這個(gè)3D打印生物陶瓷支架既有生物活性，又有高機(jī)械強(qiáng)度

來(lái)源： EngineeringForLife

多孔磷酸鈣陶瓷因其優(yōu)異的生物活性而受到廣泛關(guān)注。然而，它們較差的機(jī)械性能嚴(yán)重限制了它們的臨床應(yīng)用。在保持其生物活性的同時(shí)顯著提高多孔CaP陶瓷的機(jī)械強(qiáng)度仍然是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，四川大學(xué)樊渝江教授/周長(zhǎng)春研究員團(tuán)隊(duì)在陶瓷燒結(jié)過(guò)程中使用硫酸鈣來(lái)調(diào)節(jié)羥基磷灰石晶粒的定向生長(zhǎng)。原位取向晶粒不僅可以緩解應(yīng)力集中，還可以增強(qiáng)陶瓷晶界之間的結(jié)合力。硫酸鈣促進(jìn)磷酸鈣陶瓷中活性鈣離子的釋放，進(jìn)一步增強(qiáng)其體內(nèi)生物活性和成骨性。在超臨界骨缺損修復(fù)模型中，缺損的修復(fù)在3個(gè)月內(nèi)完成，機(jī)械恢復(fù)達(dá)到自體骨的70%以上。

相關(guān)研究成果以“3D-Printed Bioceramic Scaffolds Reinforced by the In Situ Oriented Growth of Grains for Supercritical Bone Defect Reconstruction”為題于2024年11月13日發(fā)表在《Advanced Science》上。

1. 原位晶須增強(qiáng)陶瓷的制備
首先，通過(guò)DLP技術(shù)，利用HAP-CaSO4生物鏈制備了高精度陶瓷綠色體。在燒結(jié)過(guò)程中，CaSO4可以調(diào)節(jié)HAP晶粒的取向生長(zhǎng)，形成原位晶須結(jié)構(gòu)（圖1a）。制備的多孔陶瓷支架如圖1b、c所示，其輪廓清晰，具有多孔結(jié)構(gòu)。研究者制備了含5%、10%、20%和30% CaSO4的3D打印陶瓷綠體。脫粘后，在900 ℃下保存10 h，燒結(jié)得到晶須化陶瓷樣品（分別為5、10、20和30 SH），其顯微組織如圖1d-g所示。EDS和XRD表明該材料僅由CaSO4和HAP晶體組成，并確定生成的晶須為HAP（圖1h-j）。   

圖1 原位晶須增強(qiáng)陶瓷（IWRC）的制備

2. 機(jī)械性能
為了了解原位晶須結(jié)構(gòu)對(duì)陶瓷力學(xué)性能的影響，研究者3D打印了孔隙率為68%的固體陶瓷和多孔陶瓷進(jìn)行了壓縮測(cè)試（圖2a-d）。多孔陶瓷的應(yīng)力-應(yīng)變曲線表明，所有支架都表現(xiàn)為脆性斷裂，即材料破壞后應(yīng)力迅速下降。利用原子力顯微鏡（AFM）進(jìn)一步研究了材料的納米力學(xué)性能，在原子力顯微鏡下，HAP和20SH樣品在晶粒和晶界上的三個(gè)不同點(diǎn)上測(cè)量了力-位移曲線（圖2f-m）。晶體內(nèi)的楊氏模量明顯高于晶界處的楊氏模量。材料的納米力學(xué)圖證實(shí)了陶瓷晶粒位置的力大于晶界處的力。斷口形貌表明，晶須增強(qiáng)陶瓷具有沿晶和沿晶兩種斷裂模式，而純HAP陶瓷僅表現(xiàn)為沿晶斷裂（圖2n-o）。   

圖2 機(jī)械性能

3. 機(jī)械強(qiáng)化機(jī)制
為了進(jìn)一步了解晶須原位增強(qiáng)的機(jī)理，研究者基于陶瓷的微觀結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)了二維單層結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)化模型。將原HAP晶粒簡(jiǎn)化為球形，將柱狀晶須簡(jiǎn)化為柱狀（圖3a）。從圖3c可以看出，晶須的存在顯著提高了支架的變形抗力；應(yīng)力輪廓圖顯示，無(wú)須支架的微孔中存在明顯的應(yīng)力集中。瞬態(tài)模型模擬結(jié)果顯示，陶瓷基體內(nèi)的柱狀晶須結(jié)構(gòu)有效地緩解了應(yīng)力集中，延緩了損傷的發(fā)生，提高了支架的力學(xué)性能（圖3e）。   

圖3 機(jī)械強(qiáng)化機(jī)制的有限元分析

4. 增殖與分化
隨后，研究者發(fā)現(xiàn)IWRC的降解速率與CaSO4的含量成正比，Ca2+的初始釋放主要是由CaSO4溶解引起的（圖4a-c）。利用骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）對(duì)晶須增強(qiáng)支架和HAP支架進(jìn)行體外生物相容性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，所有支架上的細(xì)胞都有明顯的增殖，且添加10% - 30% wt.%的CaSO4不會(huì)對(duì)干細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用（圖4h）。激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)一步比較了四種陶瓷支架上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況（圖4e）。   

將BMSCs植入支架進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后，觀察IWRC對(duì)BMSCs成骨分化的影響。堿性磷酸酶（ALP）染色顯示，30 SH和20 SH ALP表達(dá)強(qiáng)烈，有利于誘導(dǎo)早期成骨分化；后期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的鈣結(jié)節(jié)密度較高（圖4f）。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)幾種成骨相關(guān)蛋白，30 SH和20 SH樣品的Runx2、Col1、骨鈣素（OCN）和骨橋蛋白（OPN）均高度表達(dá)（圖4g）。

圖4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞3D打印IWRC體外評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步研究成骨分化的分子機(jī)制，研究者對(duì)沒有成骨生長(zhǎng)因子的情況下，用HAP和20 SH培養(yǎng)21天的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（圖5）。結(jié)果表明，PI3K-ART、TGF- beta和Wnt信號(hào)通路均被有效激活，其中TGF- beta信號(hào)通路富集評(píng)分最高，提示其在促進(jìn)成骨分化中起主導(dǎo)作用。   

圖5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

5. IWRC異位成骨
為了評(píng)估IWRC的骨修復(fù)能力，研究者將四組支架（30 SH、20 SH、10 SH和HAP）植入小獵犬椎旁肌肉3個(gè)月，觀察成骨現(xiàn)象（圖6a）。植入后3個(gè)月，材料從肌肉組織中取出。支架與周圍肌肉組織緊密結(jié)合，組織生長(zhǎng)到支架內(nèi)部，沒有纖維包埋的跡象（圖6b）。染色組織學(xué)分析顯示，在20 SH內(nèi)觀察到連續(xù)的骨組織（圖6e-g）。使用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析顯示，晶須增強(qiáng)組的體積明顯大于HAP組（圖6c）。這表明原位晶須增強(qiáng)陶瓷保留了其骨誘導(dǎo)特性，優(yōu)于HAP陶瓷，并顯示出進(jìn)一步應(yīng)用的潛力。抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）染色顯示，破骨細(xì)胞出現(xiàn)在四組材料中，并緊密粘附在材料表面。這表明誘導(dǎo)的骨組織具有自重塑功能（圖6h-k）。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）表明，20 SH 組Runx2 mRNA水平和OPN表達(dá)均顯著高于其他3組（圖6l-o）。   

圖6 體內(nèi)骨誘導(dǎo)評(píng)估

為了進(jìn)一步闡明IWRC增強(qiáng)成骨能力的機(jī)制，研究者在皮下植入支架1個(gè)月后對(duì)其進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖7）。結(jié)果顯示，IWRC可能通過(guò)AHSG、ACP5、IGF2、SPP1和MGP等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨能力。其中，鈣離子相關(guān)蛋白F2、FFAR2等協(xié)同調(diào)節(jié)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。  

圖7 蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析

6.IWRC在超臨界骨缺損再生中的作用
為了評(píng)估IWRC促進(jìn)臨床前超臨界骨缺損骨再生的能力，研究者建立了15 mm的兔股骨截骨缺損模型。圖8a為修復(fù)后的3D重建、單層x線片和四分之一剖面圖，比較了植入后1個(gè)月和3個(gè)月支架和股骨的整體形態(tài)。從顯微CT圖像可以清楚地觀察到，在10 SH和20 SH組中，新生的骨組織已經(jīng)融合成連續(xù)的結(jié)構(gòu)，支架已經(jīng)與骨缺損的兩端融合。結(jié)合半定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新生骨比例（BV/TV）和新生骨密度（BMD-BV）隨骨小梁厚度（Tb.Th）的增加和骨小梁間距（Tb.Sp）的減小而增加。3個(gè)月時(shí)三組新生骨體積和密度變化趨勢(shì)與第1個(gè)月一致。

圖8 IWRC在超臨界骨缺損再生中的作用

使用光學(xué)顯微鏡觀察材料和骨組織的整合。植入后一個(gè)月，材料的多孔結(jié)構(gòu)充滿了新形成的組織，未檢測(cè)到纖維包膜（圖9a）。植入后3個(gè)月，材料和骨組織緊密結(jié)合，它們之間的邊界完全模糊。支架內(nèi)新形成的組織的顏色和形態(tài)與宿主骨骼的顏色和形態(tài)非常相似（圖9b）。如圖9c-e所示，新的骨組織緊緊包裹著支架材料，新組織沿著陶瓷顆粒的表面增殖，證實(shí)了IWRC的生物相容性和生物活性。染色結(jié)果顯示，植入后1個(gè)月，缺損開始逐漸愈合，支架已與宿主骨部分融合（9g-i）。植入后三個(gè)月，20 SH組的支架結(jié)構(gòu)清晰，兩端與宿主骨完全融合（圖9j-l）。新骨組織沿外緣幾乎跨越了整個(gè)支架，組織的方向接近宿主皮質(zhì)骨的方向。新骨組織致密，類似于宿主的皮質(zhì)骨，在新骨內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量Haversian管，表明骨組織成熟。   

圖9 新骨組織的形態(tài)

綜上，本文使用CaSO4/HAP陶瓷漿料打印高精度多孔陶瓷支架，隨后在燒結(jié)過(guò)程中控制晶粒取向生長(zhǎng)，以實(shí)現(xiàn)機(jī)械增強(qiáng)的晶粒排列結(jié)構(gòu)。CaSO4可以促進(jìn)IWRC陶瓷中活性Ca2+的釋放，顯著提高HAP的骨誘導(dǎo)能力。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，IWRC可以激活鈣離子通路和成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，IWRC僅用3個(gè)月就實(shí)現(xiàn)了對(duì)超臨界骨缺損的修復(fù)，機(jī)械修復(fù)率超過(guò)了自體骨的70%。本研究協(xié)調(diào)了多孔陶瓷的生物活性和機(jī)械強(qiáng)度之間的矛盾，成功實(shí)現(xiàn)了CaP陶瓷生物活性和機(jī)械強(qiáng)度的雙重優(yōu)化。   

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1002/advs.202408459