《Lab on a Chip》：具有 7 μm 孔隙的集成生物相容性 3D 打印等孔膜

來源： EngineeringForLife

等孔膜（具有平行、有序孔隙的膜）是許多機(jī)械和生物應(yīng)用的理想選擇，如生物傳感、藥物檢測(cè)、藥物輸送、器官芯片技術(shù)、細(xì)胞分餾和其他生物分離。對(duì)多孔膜的廣泛興趣催生了許多制造技術(shù)，包括使用商業(yè)生產(chǎn)的膜、離子軌道蝕刻、水凝膠和其他立體光刻方法。此外，市售膜必須對(duì)齊、粘合或以其他方式整合到目標(biāo)設(shè)備中，從而增加了制造時(shí)間和復(fù)雜性，并需要可能具有細(xì)胞毒性的額外材料。

來自美國(guó)楊百翰大學(xué)的Gregory P. Nordin團(tuán)隊(duì)提出了一種新的3D打印技術(shù)，無需改進(jìn)傳統(tǒng)3D打印機(jī)硬件，即可在3D打印部件的負(fù)特征中實(shí)現(xiàn)原生數(shù)字微鏡設(shè)備（DMD）分辨率，并演示了孔徑小至 7 μm 的完全集成、生物兼容的等孔膜的制造。利用這項(xiàng)技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)微流控裝置，該裝置模仿了已建立的器官芯片配置，包括一個(gè)集成的異孔膜。在膜的兩側(cè)播種了兩個(gè)細(xì)胞群，并對(duì)其進(jìn)行成像，以此作為其他器官芯片應(yīng)用的概念驗(yàn)證。這些3D打印的等孔膜可用于多種其他機(jī)械和生物應(yīng)用，為無縫集成的3D打印微流控設(shè)備創(chuàng)造了新的可能性。相關(guān)工作以題為“Integrated biocompatible 3D printed isoporous membranes with 7 μm pores”的文章發(fā)表在2024年3月14日的國(guó)際頂級(jí)期刊《Lab on a Chip》。

1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容

本研究提出了一種新的3D打印方法來克服這些障礙。制作的多孔膜具有可控的孔徑和密度，并作為3D打印的一部分在原位制造。首先介紹了傳統(tǒng)3D打印技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)的效果，然后開發(fā)了一種新的曝光方法，可以在3D打印部件中實(shí)現(xiàn)具有原生微鏡尺寸的空隙，從而產(chǎn)生具有 7 μm 孔隙的多孔膜。這種大小的孔適用于許多器官芯片應(yīng)用，包括肺和胰腺模型等。然后將兩個(gè)熒光細(xì)胞群分別播種在膜的兩側(cè)，并用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行3D掃描，以顯示細(xì)胞粘附在膜上，但在膜的兩側(cè)仍保持物理上的不同，從而模仿了流行的器官芯片拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

使用 OpenSCAD 時(shí)，會(huì)生成3D STL 模型，并使用自定義切片軟件進(jìn)行切片，以生成用于單個(gè)曝光的圖像。圖 1 顯示了多孔膜幾何形狀的斜視圖以及用于曝光的單個(gè)圖像。打印完成后，用 2-丙醇清洗 3D 打印部件以去除未固化的 3D 打印樹脂，晾干，然后在定制固化站中使用 430 nm LED（Thorlabs，Newton，NJ，USA）進(jìn)行 20 分鐘的后固化，固化平面的輻照度為 11.3 mW cm-2。

圖1 多孔膜的 3D CAD 設(shè)計(jì)

【傳統(tǒng) 3D 打印方法的評(píng)估】
傳統(tǒng)的3D打印通常僅限于創(chuàng)建具有相同厚度和曝光時(shí)間的層。本研究使用 10 微米厚的層和 100 到 300 毫秒不等的各種層曝光時(shí)間，評(píng)估了這種方法可實(shí)現(xiàn)的最小孔隙。圖 2（a-c）顯示了設(shè)計(jì)寬度為 5 像素或 38 微米的孔隙的結(jié)果。請(qǐng)注意，在曝光時(shí)間較短的情況下，孔隙要比設(shè)計(jì)的大得多（圖 2（a 和 b））。通常情況下，會(huì)增加曝光時(shí)間，嘗試縮小孔隙尺寸，直到與設(shè)計(jì)尺寸一致。如圖 2（c）所示，這種方法適用于小至 38 微米的孔隙。但對(duì)于更小的孔隙（圖 2(d-f)），孔隙在達(dá)到設(shè)計(jì)尺寸之前就會(huì)關(guān)閉并完全填滿，從而形成一層固體膜（圖 2(f)）。結(jié)果表明，使用這種傳統(tǒng)的3D打印方法，沒有任何設(shè)計(jì)和曝光設(shè)置組合能產(chǎn)生小于約 30 μm 的孔。

圖2 孔隙制造的傳統(tǒng) 3D 打印方法的局限性

【零厚度層】

本研究發(fā)現(xiàn)，在暴露時(shí)間很短的情況下，暴露區(qū)域不會(huì)完全聚合到設(shè)計(jì)的 10 μm 深度，從而導(dǎo)致膜與之前暴露的塊狀材料撕裂，造成類似圖 2（a）中所見的缺陷。為緩解這一問題，引入了制造零厚度層的想法。如圖 3(a) 所示，對(duì)于每一層，構(gòu)建平臺(tái)都從凸起位置開始。如圖 3（b）所示，對(duì)于正常的 10 微米層，然后將其降低，直到 3D 打印部件的底部與樹脂托盤之間有 10 微米的間隙。然后激活紫外線源，形成厚度為 10 微米的新層，如圖 3（d）中紅色區(qū)域所示。最后，將構(gòu)建平臺(tái)升起，使部件為下一層做好準(zhǔn)備（圖 3(f)）。對(duì)于零厚度層，則將構(gòu)建平臺(tái)降低，直到 3D 打印部件與樹脂托盤之間沒有間隙（圖 3（c））。隨后的紫外線曝光會(huì)使前一層進(jìn)一步聚合（圖 3(e)），這樣就可以使用極短的曝光時(shí)間來制作具有極細(xì)細(xì)絲的薄膜。用于這種曝光的圖像應(yīng)與現(xiàn)有的塊狀材料充分重疊，以確保新曝光層與現(xiàn)有部件之間有適當(dāng)?shù)恼澈狭�，否則薄膜和細(xì)絲會(huì)被撕開。與正常情況類似，當(dāng)構(gòu)建平臺(tái)升起準(zhǔn)備下一層時(shí)，這一層就完成了（圖 3(g)）。

圖3 零厚度層示意圖

本研究使用單層零厚度膜來制造孔徑從 38 微米（5 個(gè)圖像像素）到 7.6 微米（1 個(gè)圖像像素）的膜。典型結(jié)果如圖 4 所示。每一行代表不同的設(shè)計(jì)孔徑，每一列代表不同的曝光時(shí)間。最左側(cè)的一列代表 100 毫秒的曝光時(shí)間，顯示了非常稀疏的薄膜，薄膜上的細(xì)絲在打印過程中存活下來，并一直附著在塊狀材料上。如圖 4(m)所示，即使曝光時(shí)間很短，當(dāng)孔徑為 7.6 微米時(shí)，孔也開始閉合。接下來增加曝光時(shí)間，試圖獲得更接近設(shè)計(jì)尺寸的更小孔隙。圖 4 中間一列顯示了中間曝光時(shí)間 150 毫秒的效果。對(duì)于設(shè)計(jì)尺寸大于 22 微米的膜，增加曝光時(shí)間確實(shí)有使孔變小的效果，但它們?nèi)匀槐仍O(shè)計(jì)尺寸大得多（見圖 4（b、e 和 h））。此外，雖然 15.2 μm 的孔隙在 100 毫秒的曝光時(shí)間內(nèi)是開放的（圖 4(j)），但現(xiàn)在已經(jīng)部分閉合，仍未達(dá)到設(shè)計(jì)尺寸（圖 4(k)）。7.6 μm 的孔已完全閉合（圖 4(n)）。圖 4 右欄顯示了較長(zhǎng)的 200 毫秒曝光時(shí)間的效果。設(shè)計(jì)尺寸大于 30 微米的孔隙略有縮小，但仍未達(dá)到設(shè)計(jì)尺寸（圖 4（c 和 f））。設(shè)計(jì)尺寸為 22.8 μm 的開放孔隙同樣略有縮小，但已開始閉合（圖 4(i)）。設(shè)計(jì)尺寸小于 20 μm 的孔隙現(xiàn)已完全閉合（圖 4（l 和 o））。這些結(jié)果表明，可實(shí)現(xiàn)的最小孔隙尺寸仍然約為 30 μm，無論是增加曝光時(shí)間還是減小設(shè)計(jì)尺寸，都不會(huì)產(chǎn)生更小的孔隙。

圖4 單層零厚度孔隙制造的局限性

【重復(fù)零厚度層】

本研究發(fā)現(xiàn)，使用更多的零厚度層可以制造出更小的孔隙。首先，選擇一個(gè)通常會(huì)產(chǎn)生細(xì)絲網(wǎng)的曝光時(shí)間，然后利用該曝光時(shí)間重復(fù)制作零厚度層。第一層將膜的底部制作成細(xì)絲網(wǎng)格，隨后的各層則在細(xì)絲網(wǎng)格的基礎(chǔ)上加寬每根細(xì)絲，最終形成一個(gè)孔徑更小的漸寬網(wǎng)格。這里的關(guān)鍵似乎在于構(gòu)建平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)。本研究假設(shè)，在每次曝光之間，由于構(gòu)建平臺(tái)的上下運(yùn)動(dòng)，3D 打印部件在液態(tài)樹脂中的運(yùn)動(dòng)會(huì)攪動(dòng)樹脂，使部分聚合的樹脂遠(yuǎn)離薄膜網(wǎng)格，從而在孔隙之間為后續(xù)層提供新鮮的樹脂池。然后，下一次曝光只在現(xiàn)有細(xì)絲附近完全聚合，使其變寬，而孔隙中的部分聚合樹脂則在下一次曝光前被移走。這個(gè)過程不斷重復(fù)，直到孔隙達(dá)到所需的尺寸。圖 5 顯示了實(shí)際應(yīng)用中的情況，其中每個(gè)零厚度層的曝光時(shí)間為 100 毫秒。每一行代表一個(gè)設(shè)計(jì)孔徑，每一列代表不同數(shù)量的重復(fù)零厚度層。對(duì)于設(shè)計(jì)孔徑為 38 微米的膜，5 層零厚度膜仍會(huì)產(chǎn)生不規(guī)則孔徑的膜（圖 5(a)），但 30 層零厚度膜會(huì)產(chǎn)生均勻孔徑的膜（圖 5(c)）。設(shè)計(jì)孔徑為 22.8 μm 的膜表現(xiàn)類似，如圖 5（d-f）所示。設(shè)計(jì)尺寸為 7.6 微米（單個(gè)圖像像素）的最小孔隙則表現(xiàn)較差。在膜的某些區(qū)域，重復(fù)的零厚度層確實(shí)能將孔徑減小到 7 μm，但膜最終會(huì)畸形，尤其是靠近膜中心的部分（圖 5(g-i)）。

圖5 不同孔徑的重復(fù)零厚度層的效果

【增加支撐結(jié)構(gòu)】
雖然可以實(shí)現(xiàn)小至 7 μm 的孔，但產(chǎn)生的孔網(wǎng)格可能非常不規(guī)則，特別是當(dāng)需要具有高填充因子的小孔（<20 μm）時(shí)（注意圖 5（g-i）中膜中心區(qū)域的缺陷）。本研究認(rèn)為這是由于薄膜在最初幾層開始形成時(shí)的機(jī)械不穩(wěn)定性造成的；薄絲在液態(tài)樹脂中移動(dòng)時(shí)很容易被構(gòu)建平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)所移位。為了緩解這一問題，可以添加底層支撐柱。圖 6(a) 顯示了放置在薄膜下方的支撐柱（紅色）。圖 6(b) 顯示的是省略薄膜后的支柱外觀。請(qǐng)注意，在圖 6（c）中，支撐柱的寬度大于單個(gè)孔隙之間的空間，導(dǎo)致部分孔隙被堵塞。如圖 6(d)所示，支撐物提高了初始結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并產(chǎn)生了 7 μm × 7 μm 的均勻孔隙，而且沒有已知的跨度限制。制作這些膜需要非常好的光學(xué)聚焦。一旦獲得了良好的聚焦，并確定了適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間和重復(fù)層數(shù)，就能以很高的成功率重復(fù)制作膜。膜一開始很薄，但隨著隨后的曝光會(huì)變厚。測(cè)得的薄膜平均厚度為 12.6 微米。如果需要更高的孔隙填充系數(shù)，也可以制作出具有 8 μm 孔隙的棋盤圖案，如圖 7 所示。該棋盤格圖案的制作采用了 300 毫秒的批量曝光時(shí)間和 25 層零厚度膜，膜的曝光時(shí)間為 100 毫秒。這種棋盤圖案的制作難度很大，目前只能制作出跨度約為 60 微米的圖案。

圖6 由 30 層零厚度膜和支撐柱組成的等孔膜

圖7 用 25 層零厚度膜制造的等孔膜，顯示出具有 8 微米孔隙的高填充因子棋盤圖案

【集成到器官芯片啟發(fā)裝置中】
使用類似圖 6（c）所示的膜，制作了一個(gè)完全3D打印的微流控裝置，并在膜腔上增加了頂蓋和通道，以便在膜的兩側(cè)播種細(xì)胞培養(yǎng)物。該裝置的 CAD 圖如圖 8（a） 和 （b）所示。按照上述方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行播種和成像，得到的圖像如圖 8（c-f）所示。圖 8(c)顯示的是膜的顯微鏡圖像，其中底層支撐和孔都清晰可見。圖 8(d)和(e)為俯視圖和斜視圖，兩個(gè)細(xì)胞群均清晰可見。最后，圖 8(f)顯示的是側(cè)視圖，兩個(gè)細(xì)胞群都粘附在膜的表面，但在膜的兩側(cè)仍有物理上的區(qū)別，模擬了許多器官芯片應(yīng)用中常見的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

圖8 膜設(shè)備的 CAD 圖紙和3D共聚焦熒光圖像，膜上有兩個(gè)細(xì)胞群種子

2. 總結(jié)與展望
傳統(tǒng)的 3D 打印工藝具有很大的局限性。本研究通過引入無需對(duì)3D打印機(jī)硬件本身進(jìn)行任何修改即可創(chuàng)建更小空隙的功能，擴(kuò)展了通用3D打印技術(shù)。具體來說，這項(xiàng)技術(shù)有助于在膜內(nèi)精確放置空隙，從而創(chuàng)建出具有可控孔徑、定位和密度的等孔膜。這種方法加快并簡(jiǎn)化了高度集成的微流控設(shè)備的生產(chǎn)，因?yàn)槟な怯门c設(shè)備其他部分相同的材料無縫制造的，不需要額外的材料或工藝。此外，這種技術(shù)與生物相容性樹脂兼容，因此對(duì)于涉及活細(xì)胞的應(yīng)用（如器官芯片）來說非常寶貴。這項(xiàng)技術(shù)還有可能應(yīng)用于其他3D打印機(jī)和樹脂，從而提高3D打印工藝的精度和多功能性，尤其適用于微流控技術(shù)。

文章來源：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/lc/d4lc00014e