華西口腔郭維華IJB：利用擠出式3D打印構(gòu)建HERS-DPCs/GelMA支架促進(jìn)牙槽骨再生

來(lái)源： EFL生物3D打印與生物制造

赫特維希上皮根鞘（HERS），是牙發(fā)育過(guò)程中內(nèi)釉上皮和外釉上皮向根尖方向生長(zhǎng)形成的雙層上皮結(jié)構(gòu)，HERS內(nèi)側(cè)是牙乳頭細(xì)胞（DPCs），在牙根發(fā)育過(guò)程中，HERS可誘導(dǎo)DPCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，后者參與根部牙本質(zhì)的形成。然而，HERS僅在牙根發(fā)育的特定時(shí)期短暫出現(xiàn)，原代HERS細(xì)胞數(shù)量少、不易獲取，常規(guī)的二維培養(yǎng)環(huán)境容易使其上皮特性丟失，從而失去誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化的功能。如何維持HERS的上皮特性，充分發(fā)揮上皮間充質(zhì)間的相互作用，是牙及其支持組織再生研究的一個(gè)難點(diǎn)。

最近，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院的郭維華教授團(tuán)隊(duì)基于擠出式3D生物打印技術(shù)利用GelMA水凝膠重組SD大鼠來(lái)源的HERS細(xì)胞和DPCs，并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證HERS-DPCs/GelMA支架的成骨能力。相關(guān)論文“3D-bioprinted Recombination Structure of Hertwig’s Epithelial Root Sheath Cells and Dental Papilla Cells for Alveolar Bone Regeneration”發(fā)表在International Journal of Bioprinting雜志上，第一作者為唐慧琳碩士，通訊作者為郭維華教授。

該研究的總體思路是根據(jù)牙發(fā)育過(guò)程中HERS和DPCs的空間位置關(guān)系設(shè)計(jì)“層狀結(jié)構(gòu)”模型，以GelMA水凝膠為支架材料，通過(guò)擠出式3D打印技術(shù)構(gòu)建HERS-DPCs/GelMA結(jié)構(gòu)，并將支架植入SD大鼠的牙槽窩缺損，驗(yàn)證該支架產(chǎn)生礦化組織、促進(jìn)牙槽骨缺損修復(fù)的能力，為牙相關(guān)組織工程和上皮-間充質(zhì)相互作用研究提供新思路。

首先，研究人員從SD大鼠乳鼠牙胚中獲取HERS細(xì)胞和DPCs，光鏡下觀察到HERS細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，形狀如鋪路石，DPCs則呈長(zhǎng)梭形。免疫熒光染色結(jié)果顯示：上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK14和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin在HERS細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá)，提示HERS細(xì)胞已發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)具有上皮和間充質(zhì)細(xì)胞的特性（圖1，A）。

然后，用10% w/v的GelMA溶液分別重懸HERS細(xì)胞和DPCs，獲得細(xì)胞密度約為1×106/ml的生物墨水用于3D打印。該研究利用擠出式3D打印機(jī)的兩個(gè)打印頭，可實(shí)現(xiàn)兩種生物墨水的組合式打印，如先打印一層HERS細(xì)胞，接著打印兩層DPCs，制備HERS-DPCs立體層狀結(jié)構(gòu)，同樣大小含單一細(xì)胞的立體結(jié)構(gòu)作為對(duì)照�；�/死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在培養(yǎng)后的第1、4和7天，GelMA支架中活細(xì)胞比例均在80%以上，證明GelMA有優(yōu)異的生物相容性，適宜細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖1，B和C）。

圖1 HERS細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和活力

為了進(jìn)一步探究HERS-DPCs/GelMA支架中兩種細(xì)胞的相互作用，研究人員利用熒光染料DiO和DiL分別將DPCs和HERS細(xì)胞標(biāo)記為綠色和紅色，并在共聚焦顯微鏡下于三維打印后的第0、3和8天進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第8天時(shí)，兩種細(xì)胞發(fā)生遷移，二者的界限也變得模糊（圖2）。

圖2 體外HERS-DPC相互作用

光鏡和掃描電鏡的結(jié)果表明，3D打印的立體層狀結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)格狀，孔隙均勻，直徑約為0.8 mm。從培養(yǎng)后的第3天開(kāi)始，細(xì)胞從GelMA支架中爬出，并大量增殖，第4天時(shí)的細(xì)胞匯合度高達(dá)80%，表明此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。隨后，研究人員通過(guò)SD大鼠的牙槽窩移植實(shí)驗(yàn)評(píng)估HERS-DPCs/GelMA支架的骨再生效果。該實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)組，分別為空白組、HERS細(xì)胞（3D）組、DPCs（3D）組、HERS-DPCs（3D）組和HERS-DPCs混合組，空白組不植入任何材料，HERS-DPCs混合組是將兩種細(xì)胞直接與GelMA水凝膠混合，不進(jìn)行3D打印。選取8周齡的雌性SD大鼠，拔除右上頜第一、第二磨牙，然后用牙科種植機(jī)預(yù)備牙槽窩，將樣本植入后嚴(yán)密縫合（圖3）。

圖3 打印結(jié)構(gòu)的顯微觀察及牙槽窩移植

觀察8周后取材進(jìn)一步分析。HE、Masson染色結(jié)果顯示各組手術(shù)區(qū)域均有新形成的膠原纖維，空白組的纖維相對(duì)更少、更薄。免疫組化染色結(jié)果表明：DPCs（3D）組和HERS-DPCs（3D）組的成骨相關(guān)標(biāo)志物（COL-I、OCN、RUNX-2）均有陽(yáng)性表達(dá)，且HERS-DPCs（3D）組有明顯的新骨生成（圖4）。

圖4  8周后通過(guò)HE染色、Masson染色及免疫組化染色評(píng)價(jià)牙槽骨種植情況

該研究基于擠出式3D生物打印利用GelMA重組HERS細(xì)胞和DPCs，并通過(guò)牙槽窩移植實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組結(jié)構(gòu)的成骨性能。研究結(jié)果表明GelMA具有優(yōu)異的生物相容性，有利于細(xì)胞增殖、遷移等活動(dòng)。3D打印的方式最大程度地模擬體內(nèi)牙發(fā)育過(guò)程中的微環(huán)境，構(gòu)建的HERS-DPCs共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)中，HERS細(xì)胞和DPCs發(fā)生遷移，植入SD大鼠牙槽窩缺損后有利于牙槽骨再生。該研究為牙源性上皮-間充質(zhì)相互作用的研究提供了新策略。

文章來(lái)源：
http://doi.org/10.18063/ijb.v8i3.512