生物3D打印進展綜述：從打印方法到生物醫(yī)學應用

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在過去的幾十年中，生物3D打印已被廣泛地應用于構建如皮膚、血管、心臟等諸多組織/器官原型，，這不僅為器官替換的宏偉目標奠定基礎，也可作為體外病理模型服務于藥物篩選、器官發(fā)育及病變等領域�？紤]到器官/組織有復雜的結構，種類繁多的生物3D打印方法被開發(fā)出來用以針對不同的應用場景。如何根據應用需求來選擇合適的生物打印方法？本綜述中我們系統(tǒng)地回顧了生物3D打印的發(fā)展、工藝流程和分類，重點介紹了打印的基本原理和商業(yè)化的生物打印設備；對擠出式、液滴式和光固化式生物3D打印進行了總結和分類，并對其應用提出了建議；我們認為未來比較會廣泛應用的三個生物3D打印技術是投影式光固化打印、懸浮支撐打印及同軸打��；而設計生物墨水的要點是在可打印性、生物相容性和機械性能三者中找到平衡點。

相關綜述以題為“Development of 3D Bioprinting: FromPrinting Methods to Biomedical Applications”被Asian Journalof Pharmaceutical Sciences在線刊登，顧則明博士生為一作，賀永教授為通訊作者。

我們認為：生物3D打印技術仍有著很大的進步空間。組織/器官的復雜程度給精確的生物打印帶來了很大的困難，為解決這一問題，多尺寸、多材料、多細胞的生物打印將成為未來發(fā)展的重點。與天然組織/器官相比，生物打印的精度較低，這是目前生物打印技術的主要缺點之一。而另一個常見缺點是大尺寸復雜結構的打印速度慢，特別是涉及到多材料交替打印。此外，作為生物3D打印關鍵應用的體外組織模型不僅在尺寸上需要標準化，在生物相容性能和力學性能上也需要標準化，這就對生物打印技術的均勻性和再現(xiàn)性提出了更高的要求。相較于其他打印方法，投影式光固化生物3D打印技術在這些方面有著不小的優(yōu)勢。

生物墨水的開發(fā)和應用是生物打印技術的關鍵。研究開發(fā)并穩(wěn)定合成能夠平衡可打印性、生物相容性和機械性能這三方面的新型生物墨水是生物3D打印應用的基礎。目前的許多研究仍局限于使用有限范圍的生物材料，而大多數(shù)人體組織/器官都有ECM成分的復雜組合，具有特定的生物學或力學影響，單一的生物墨水不可能建立一個“合成”的微環(huán)境來模擬體內的實際情況，這也使得多材料生物打印日益重要。

血管化是生物打印活體結構的基礎。與組織工程和再生醫(yī)學領域面臨的挑戰(zhàn)一樣，確保打印結構充分的血管化是生物3D打印的關鍵因素。有效構建多尺度的灌注血管網絡，通過機械或化學刺激促進其血管化，是生物制造放大組織的基礎。雖然建立血管網絡的方法有多種，但每種方法都有其局限性，如噴墨生物打印和實驗室打印分辨率高，但難以構建復雜的血管網絡；基于犧牲材料的生物打印需要一個復雜的二次成型過程；同軸生物打印具有構建多尺寸流道的可行性和灌注培養(yǎng)的能力，在血管化領域有著廣闊的應用前景。

實現(xiàn)功能化是生物3D打印的首要目標。目前的大多數(shù)研究仍集中在打印過程和機制，這是面向制造業(yè)的想法，而生物3D打印功能化的核心因素是要從基礎研究到實際應用。為實現(xiàn)功能化，生物墨水需要具備良好的生物相容性和力學性能，以滿足營養(yǎng)灌注和植入的要求。同時，構建模擬體內微環(huán)境的場景，包括力學和化學刺激，對打印結構的功能化也至關重要。

3D打印就好比切土豆的逆過程，切土豆是將土豆加工成土豆片、土豆絲、土豆丁或土豆泥，而3D打印則是將土豆片、土豆絲、土豆丁或土豆泥反向組裝成土豆的過程，這四個過程就對應了四種典型的3D打印工藝：采用投影光固化組裝的數(shù)字光處理（DLP）、采用纖維堆疊組裝的熔融沉積（FDM）、采用微球進行組裝的噴墨打印以及采用粉末燒結進行組裝的選擇性激光燒結（SLS）（圖1）。

而生物3D打印是一門與機械、材料、生物、醫(yī)學等多學科緊密相關的前沿技術。從廣義上來說，直接為生物醫(yī)療領域服務的3D打印都可視為生物3D打印的范疇，而從狹義上來定義，通常將操縱含細胞生物墨水構造活性結構的過程稱之為生物3D 打印，此概念也可稱之為細胞打印。我們系統(tǒng)總結了生物3D打印的發(fā)展歷程（圖2）和工藝流程（圖3）。



圖1 四種切土豆方式對應四種典型3D打印工藝


圖2 生物3D打印回顧


圖3 生物3D打印工藝流程

根據不同的打印原理和打印材料，我們整理了生物3D打印的分類，把常見的生物3D打印方法分為了擠出式、液滴式、光固化式三類。簡單來說，擠出式生物打印通過擠出生物墨水形成連續(xù)纖維來搭建結構；液滴式生物打印生成離散液滴堆積成型；光固化生物打印利用光敏材料進行光固化并逐層堆疊，實現(xiàn)三維模型。擠出式生物打印可根據不同的出液方式，分為氣動擠出式、活塞擠出式和螺旋擠出式三種（圖4）。


圖4 擠出式生物打印原理

依據不同的液滴成形原理，我們可以把液滴式生物打印分為噴墨式、電流體動力噴射式（EHDJ）和激光輔助式（LAB）等。這其中，噴墨式生物打印常見的有熱泡式、壓電式等，而激光輔助式生物打印又可細分為激光引導直寫（LGDW）和激光誘導前移(LIFT)（圖5）。



圖5液滴式生物打印原理

光固化式生物打印可根據光掃描的方式不同分為立體光刻（SLA）和數(shù)字光處理（DLP）等。目前SLA技術在支架打印中應用較多，但在載細胞打印的應用并不多見。而DLP技術因其有著打印精度高、速度快、均一性好等優(yōu)點越來越受到學術界的關注（圖6）。



圖6 DLP打印原理

我們詳細描繪了不同生物打印方法在生物醫(yī)學領域的應用，包括在皮膚、骨/軟骨、神經、肌肉/肌腱、脂肪、脊髓、血管/血管化、類器官、藥物研究/腫瘤模型、臨床應用等方面的研究現(xiàn)狀，也總結概述了市場上知名的商業(yè)化生物打印設備，同時還對目前較為火熱的多材料生物打�。▓D7）和同軸生物打印（圖8）進行了細致的闡述。



圖7 多材料生物打印的應用


圖8 同軸生物打印的應用

各種生物打印方法被發(fā)明出來用以針對不同的應用場景，相應地，每種生物打印方法也有著各自的優(yōu)缺點。

擠出式生物打印是目前應用最為廣泛的生物打印方法，其最大的優(yōu)勢在于可打印的生物相容材料范圍廣泛（包括細胞團、載細胞水凝膠、微載體、脫細胞基質成分等），涵蓋了粘度范圍從30mPa/s 到6×10^7mPa/s的生物材料，尤其是具有剪切變稀、快速交聯(lián)特性的水凝膠材料。這意味著能為維持細胞活力和功能化提供合適微環(huán)境的低粘度材料，與能為打印結構提供力學支持的高粘度材料都能與擠出式生物打印很好地結合。同時，擠出式生物打印也有著良好的經濟性和易用性等優(yōu)點，與多材料、同軸生物打印可緊密結合。但擠出式生物打印也有著一些缺陷：首先，其打印精度相對其他生物打印方式較低，一般在100μm量級；其次，生物墨水的選擇需要兼顧凝膠化、固化、剪切變稀等性質；此外，由于擠出過程中不可避免的剪切力可能會影響細胞存活率，這在打印細胞密度較高的生物墨水時更為明顯。

噴墨式生物打印有著成本低、精度高、速度快等優(yōu)點，也可針對性地配備多個噴嘴，以滿足在同一時間打印不同的細胞、生物材料或生長因子的需求。然而，用于噴墨打印的生物墨水粘度要求限制了其適用生物材料的范圍；由于驅動壓力小，噴墨生物打印無法打印高粘度材料或高濃度細胞，用噴墨技術實現(xiàn)生理細胞密度的生物打印是目前比較困難的，而低粘度材料會降低打印成型的結構強度，導致不滿足后續(xù)體外培養(yǎng)和移植的要求；此外，噴墨打印過程中可能會對細胞造成機械或熱損傷，噴頭也易損耗，這些缺點限制了噴墨生物打印技術的廣泛應用。

激光輔助式生物打印相較于前兩者有著一個先天優(yōu)勢：其無噴嘴的打印模式就避免了細胞/生物材料堵塞噴嘴的問題；同時這也避免了生物墨水與器件的直接接觸，這種非接觸式制造方法不會對細胞造成機械損傷。其打印高粘度生物墨水的生物材料選擇范圍比噴墨打印更廣，打印精度甚至能達到生成含單個細胞的液滴。但激光輔助生物打印有幾個明顯的缺點：首先，成本相對較高，且缺乏商業(yè)化的打印設備，而適合激光生物打印的水凝膠材料并不多；其次，該方法自動化程度不高，如LIFT原理所述，每層墨水靠一次次涂層上去，不僅均一性得不到保證，且費時費力，導致其很難應用于復雜結構打印。

DLP是一種基于面投影的生物3D打印方法，相比應用廣泛的擠出式打印有著更高的打印分辨率和可重復性。根據DLP的成型原理，它在打印速度上有很大的優(yōu)勢，因為無論結構多么復雜，每一層的打印時間都不會增加。此外，與噴墨生物打印中液滴之間、或擠出式打印的相鄰纖維之間形成的“邊界”相比，DLP技術可以更平滑地堆疊三維結構，從而大大提高了結構的完整性和力學性能。在光固化打印工藝中，未固化的液態(tài)生物墨水可以為打印結構提供良好的支撐，避免打印過程中水凝膠的坍塌變形；與LAB相同，無噴嘴的打印模式使得噴嘴堵塞、剪切力影響細胞活性等問題不再是困擾。我們認為，光固化生物打印技術將在細胞生物打印技術中發(fā)揮越來越重要的作用，有望取代擠出式生物打印成為未來最為主流的生物3D打印技術。

而生物墨水的性能大致可從三個方面予以評價：可打印性、生物相容性和機械性能（圖9）�？纱蛴⌒允窃u估生物墨水的可成型性，包括可調節(jié)的生物材料粘度、從溶膠態(tài)到凝膠態(tài)的快速轉換性質，以及大范圍的可打印參數(shù)等。生物相容性要求生物墨水盡可能地與人體中細胞微環(huán)境相似，使細胞在其中增殖、擴展、分化并交互。機械性能要求凝膠態(tài)的生物墨水力學性能夠強，以支持隨后的培養(yǎng)和植入過程；生物打印的結構通常需要在體外培養(yǎng)，在此期間常常伴隨著營養(yǎng)物質的灌注和降解，需要相當?shù)膹姸戎С�；機械性能不足也會導致移植失敗。



圖9 生物墨水性能的評價標準

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.ajps.2019.11.003