《Acta Biomater.》：3D打印彈性生物材料減輕體外血管生成過程中的壓縮現(xiàn)象

來源： EngineeringForLife

生物組織需要最佳的質(zhì)量運輸來支持代謝平衡。在生理上，這是通過復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)的，該網(wǎng)絡(luò)支持氧氣和重要代謝物的流入，以及廢物的清除和旁分泌信號的循環(huán)。如果沒有這個龐大的網(wǎng)絡(luò)，組織就只能依靠擴散運輸，而擴散運輸?shù)男�率通常只有幾百微米。因此，在�?gòu)建工程組織或細胞療法時，以有利于高效運輸?shù)姆绞皆O(shè)計平臺對于支持其在體內(nèi)長期存活和移植至關(guān)重要。大多數(shù)細胞植入成功的一個關(guān)鍵參數(shù)是形成完整而全面的植入體內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)。預(yù)血管化，即移植前在體外生成血管結(jié)構(gòu)，可通過吻合加速植入物的灌注。然而，這種技術(shù)的可擴展性和整合的簡易性阻礙了臨床轉(zhuǎn)化。在基于纖維蛋白的血管生成方法中，在血管樣結(jié)構(gòu)形成過程中，脆弱的水凝膠基質(zhì)會發(fā)生重塑和降解，導(dǎo)致細胞介導(dǎo)的構(gòu)建物快速壓縮，從而形成致密的毛細血管樣結(jié)構(gòu)，網(wǎng)絡(luò)覆蓋效果不佳。

為了解決這些難題，來自美國佛羅里達大學的Cherie L. Stabler團隊將血管生成水凝膠嵌入高多孔性、生物穩(wěn)定性的3D聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架中。通過對3D打印模具進行反向鑄造，支架呈現(xiàn)出高度互聯(lián)和可重復(fù)的孔隙結(jié)構(gòu)。孔隙大小是通過對裝置內(nèi)血管生成的體內(nèi)篩選進行優(yōu)化的。PDMS 框架與血管生成水凝膠的結(jié)合大大減少了纖維蛋白在體外的壓縮，與單獨使用纖維蛋白水凝膠相比，這種結(jié)構(gòu)易于操作，尺寸可預(yù)測，表面積增大。從整體上看，PDMS 框架改變了血管的形態(tài)發(fā)生，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)明顯增大，密度降低。血管生成蛋白質(zhì)組學評估顯示，添加 PDMS 框架會對時間產(chǎn)生影響，表明細胞增殖和遷移信號發(fā)生了改變。這項工作為改進轉(zhuǎn)化前血管網(wǎng)絡(luò)的生成建立了一個平臺，使其具有更大的靈活性，以滿足臨床規(guī)模的工程組織需求。相關(guān)工作以題為“3D Printed Elastomeric Biomaterial Mitigates Compaction During In Vitro Vasculogenesis”的文章發(fā)表在2023年9月20日的國際頂級期刊《Acta Biomaterialia》。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容
在開發(fā)這些高度組織化的硅樹脂支架時，可重現(xiàn)的幾何特征被認為是體內(nèi)血管生成和預(yù)血管網(wǎng)絡(luò)形成一致性的關(guān)鍵。因此，本研究選擇了熔融沉積建模3D打印技術(shù)，因為該技術(shù)在微觀尺度上可重現(xiàn)幾何特征的能力已得到充分證明，可定義明確的孔隙大小。利用建模創(chuàng)建了所需支架幾何形狀的“負”模。隨后用水溶性 PVA 長絲打印出該模型，以便在支架制作完成后移除（圖 1A-B）。然后將熱固化 PDMS 硅酮注入 PVA 模具的 “正”面空間，在 PVA 模具水溶之前進行交聯(lián)（圖 1C-D）。利用這種反向鑄造方法，本研究制造出了兩種不同的支架孔隙幾何形狀：300 微米和 150 微米（圖 1 E-F）。此外，還制作了孔徑更大的 600 微米支架，但其機械穩(wěn)定性不足以進行后續(xù)的細胞和植入研究。

圖1 3D打印硅樹脂支架（3DPSS）的制作方法與評價

為了生成所需的前血管網(wǎng)絡(luò)，HUVEC 和 NHLF 細胞群被包裹在犧牲纖維蛋白水凝膠中。然后將這種水凝膠注入 3DPSS 平臺的開放孔中，以確定支架包合是否能在不出現(xiàn)游離水凝膠中通常觀察到的劇烈壓縮的情況下形成網(wǎng)絡(luò)（圖 2A）。本研究使用立體顯微鏡觀察了游離纖維蛋白水凝膠和 V-3DPSS 在 48 小時內(nèi)的整體壓縮情況，以確定支架包合的益處。僅培養(yǎng) 12 小時后，就觀察到有無支持性 3DPSS 的纖維蛋白水凝膠的壓縮度發(fā)生了明顯變化，游離纖維蛋白水凝膠和 V-3DPSS 的表面積相差 5.3 倍（分別為 16 ± 3.5 mm2 和 84.41 ± 3.86 mm2；P < 0.0001）（圖 2B、C）。24 小時后，游離纖維蛋白水凝膠的表面積出現(xiàn)了非常顯著的下降（P < 0.0001，下降了 2.6 倍），而 V-3DPSS 則保持不變（P = 0.082）。48 小時后，壓縮逐漸減弱，因為 V-3DPSS 和游離纖維蛋白水凝膠的表面積在 24 小時和 48 小時之間都沒有顯著變化。總體而言，雖然 V-3DPSS 在培養(yǎng) 2 天后表面覆蓋面積略有變化（6.8%）（P = 0.038），但 V-3DPSS 阻止了游離纖維蛋白水凝膠中出現(xiàn)的高達4.2 倍的減少。

圖2 時間水凝膠壓縮和網(wǎng)絡(luò)表面積的成像和量化

研究表明，壓縮在血管生成過程中發(fā)揮著重要作用，而且很可能是關(guān)鍵作用；因此，細胞組織的時間變化有望成為調(diào)節(jié)壓縮的結(jié)果。對自由培養(yǎng)或限制在 V-3DPSS 內(nèi)的纖維蛋白水凝膠中內(nèi)皮細胞自我組裝的時間變化進行的研究發(fā)現(xiàn)，細胞組織發(fā)生了明顯變化。不出所料，自由纖維蛋白水凝膠中的細胞經(jīng)歷了高度壓縮，水凝膠表面積大幅縮小。此外，在早期時間點還能觀察到細胞形態(tài)的顯著差異。具體來說，在第 3 天，兩組都出現(xiàn)了主要由單細胞組成的稀疏結(jié)構(gòu)（圖 3Ai、3Ci）；然而，與游離纖維蛋白水凝膠相比，V-3DPSS 組（圖 3Di）的細胞表現(xiàn)出內(nèi)皮細胞聚集，多細胞結(jié)構(gòu)的質(zhì)量更高（圖 3Ai）。到了第 5 天，有更多的證據(jù)表明，游離纖維蛋白水凝膠（圖 3Bii）和 V-3DPSS （圖3Dii）中都出現(xiàn)了絲狀結(jié)構(gòu)。然而，V-3DPSS 中的細胞仍主要表現(xiàn)為細胞集群模式，并從這些原生球體中延伸出芽狀結(jié)構(gòu)。到第 7 天，兩組細胞都顯示出已建立的相互連接的網(wǎng)絡(luò)；然而，血管網(wǎng)絡(luò)密度的視覺差異非常明顯，游離纖維蛋白水凝膠與 V-3DPSS 相比，顯示出重疊和壓縮的分支網(wǎng)絡(luò)（圖 3B iii和圖 3D iii）。

圖3 血管前網(wǎng)絡(luò)時間進展成像

為了進一步探究 PDMS 框架對纖維蛋白血管生成的影響，本研究在培養(yǎng) 7 天后使用免疫熒光染色和共聚焦成像技術(shù)觀察了所生成網(wǎng)絡(luò)的微觀形態(tài)。通過肌動蛋白染色可觀察到游離纖維蛋白水凝膠含有高度緊密的細胞培養(yǎng)物（圖 4A i）。如圖所示，大量重疊的細胞給清晰成像帶來了挑戰(zhàn)，而且信號不會飽和。僅聚焦于 CD 31+ 內(nèi)皮細胞（圖 4A ii），可觀察到具有高度連接形態(tài)的致密網(wǎng)絡(luò)。到第 7 天，純纖維蛋白水凝膠的橫截面也顯示出一個薄的高度致密的 CD 31+ 網(wǎng)絡(luò)（圖 4B i），并有證據(jù)表明存在類似管腔的中空結(jié)構(gòu)（圖 4CB ii）。加入 PDMS 框架（V-3DPSS 組）后，網(wǎng)絡(luò)形態(tài)明顯不同，整體細胞密度發(fā)生了視覺變化（圖 4C i）。共培養(yǎng)的形態(tài)似乎符合支架的幾何形狀，填充了 3DPSS 的徑向和軸向孔隙。以 CD 31+ 細胞為重點（圖 4C ii），在開放的框架內(nèi)觀察到連續(xù)的管狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)在 x 和 y 方向上圍繞孔纏繞。值得注意的是，V-3DPSS 的橫截面尺度和形態(tài)發(fā)生了明顯變化，整體上更厚的血管結(jié)構(gòu)包含更大、更清晰的管腔狀結(jié)構(gòu)（圖 4D I 和 ii）。

圖4 在第 7 天對游離纖維蛋白水凝膠和（V3DPSS）進行免疫熒光染色和共聚焦成像的結(jié)果

本研究通過圖像分析對這些形態(tài)變化進行量化。為了捕捉細胞空間密度的變化，測量了構(gòu)建體開放空間內(nèi)細胞覆蓋的百分比（%）（圖 5Ai）。與游離纖維蛋白水凝膠相比，在頂部平面（x-y）上，V-3DPSS 的 CD 31+ 結(jié)構(gòu)覆蓋率總體下降了 29%；但這一差異并不顯著（P < 0.122）（圖 5A ii）。為了描述培養(yǎng)一周后內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡(luò)的厚度（z 維度），生成了共聚焦圖像的3D投影和深度圖。支架框架對整個內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡(luò)厚度的影響非常明顯，與游離纖維蛋白水凝膠相比，V-3DPSS 組增加了 3.6 倍（圖 5B ii，P < 0.0001）。為了說明這些差異對網(wǎng)絡(luò)形態(tài)的影響，對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的平均直徑、最大直徑和最小直徑進行了量化（圖 5C）。不同培養(yǎng)條件下的圖像分析表明，與游離纖維蛋白水凝膠相比，V-3DPSS 組的平均結(jié)構(gòu)直徑顯著增加（P < 0.0001）（圖 5C ii）。此外，V-3DPSS 組每個結(jié)構(gòu)的平均最大直徑顯著增加（P < 0.0001）（圖 5C iii），而平均最小直徑則未受到支架包被的顯著影響（P = 0.85）（圖 5C iv）。這些結(jié)果支持肉眼觀察到的 V-3DPSS 組網(wǎng)絡(luò)直徑增加和直徑多樣性增強。

圖5 在第 7 天確定整體網(wǎng)絡(luò)覆蓋、網(wǎng)絡(luò)厚度和結(jié)構(gòu)直徑的圖像分析結(jié)果

有跡象表明，支架的加入弱化了壓縮效果，影響了細胞的分布和形態(tài)，因此本研究利用廣泛的血管生成蛋白質(zhì)組學分析進一步確定了細胞變化的背景。在第 3 天和第 7 天測量了純纖維蛋白或 V-3DPSS 的蛋白質(zhì)陣列。蛋白質(zhì)陣列結(jié)果的匯總熱圖顯示為與純纖維蛋白第 3 天水平的折疊變化，說明了支架和時間對共培養(yǎng)蛋白質(zhì)含量的影響（圖 6）。與純纖維蛋白對照組相比，支架的存在僅在第 3 天影響了全局“血管生成”蛋白的表達（P = 0.041；MANOVA），但這種影響在第 7 天消除（P = 0.539；MANOVA）。此外，時間對 V-3DPSS 組是一個重要因素（P = 0.011），但對純纖維蛋白對照組不是（P = 0.193；MANOVA）。對單個蛋白質(zhì)組影響的事后比較發(fā)現(xiàn)，在測試的組別或時間點之間，沒有任何特定蛋白質(zhì)發(fā)生顯著變化，這表明蛋白質(zhì)組受到多種驅(qū)動因素的廣泛影響。

圖6 高通量陣列量化共培養(yǎng)物內(nèi)蛋白質(zhì)的時間熱圖

通過確定各組培養(yǎng) 3 天和 7 天后所測蛋白質(zhì)的相關(guān)系數(shù)，本研究進一步確定了血管生成蛋白質(zhì)組的特征。有了如此龐大的數(shù)據(jù)集，確定哪些蛋白質(zhì)在數(shù)據(jù)集中具有廣泛的負相關(guān)性，就能大范圍地推斷出封裝細胞的狀態(tài)以及不同組間隨著時間的推移如何進行比較。通過計算第 3 天 V-3DPSS 組中表達的蛋白質(zhì)的相關(guān)系數(shù)（圖 7A），測得大多數(shù)蛋白質(zhì)之間總體呈正相關(guān)，但也有一些關(guān)鍵的例外情況；該數(shù)據(jù)集中呈負相關(guān)的蛋白質(zhì)包括絲裂蛋白 E1、催乳素、血管內(nèi)皮生長因子-C 和凝血因子 III。與 V-3DPSS 組相比，對游離纖維蛋白水凝膠進行同樣的分析也發(fā)現(xiàn)了類似的正相關(guān)蛋白質(zhì)；不過，與數(shù)據(jù)集負相關(guān)的蛋白質(zhì)群有所不同，特別是 DPPIV、內(nèi)皮素-1、TIMP-1、凝血酶原-1、血管生成素-1/2 和 FGF-7（圖 7C）。對第 7 天相關(guān)系數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，V-3DPSS（圖 7B）和游離纖維蛋白水凝膠（圖 7D）的蛋白質(zhì)組概況相似，只有極少數(shù)蛋白質(zhì)與整個數(shù)據(jù)集呈負相關(guān)。V-3DPSS 網(wǎng)絡(luò)顯示 serpin E1、TIMP-1 和 thrombospondin-1 與數(shù)據(jù)集呈負相關(guān)，而游離纖維蛋白水凝膠具有與 V-3DPSS 相似的鑒定群體，即 serpin E1、TIMP-1、thrombospondin-1 和 DPPIV。

圖7 顯示基于培養(yǎng)條件和時間的不同表達蛋白之間關(guān)系的皮爾遜相關(guān)矩陣

2. 總結(jié)與展望
可重復(fù)的3D打印高多孔支架促進了體內(nèi)血管生成和體外預(yù)血管生成。在基于纖維蛋白的血管生成過程中加入3D PDMS 支架，可有效減輕以前認為網(wǎng)絡(luò)形成所必需的大尺度壓縮，而不會影響血管樣網(wǎng)絡(luò)的形成。由此形成的厚構(gòu)造提供了一種可轉(zhuǎn)移的網(wǎng)絡(luò)，其網(wǎng)絡(luò)覆蓋范圍大大提高，有可能用于基于細胞的組織工程療法。壓縮的減輕對宏觀和微觀形態(tài)都有影響，結(jié)構(gòu)間距、網(wǎng)絡(luò)厚度和結(jié)構(gòu)直徑都發(fā)生了明顯變化，從而增強了細胞在整個構(gòu)建體中的空間分布。通過蛋白質(zhì)組學評估觀察到的整體蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)關(guān)系極化的時間變化，凸顯了早期共培養(yǎng)動態(tài)的改變。這項工作強調(diào)了一種生成大規(guī)模預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)的方法，具有提高工程組織存活率的轉(zhuǎn)化潛力。未來的研究將側(cè)重于評估支架的加入對預(yù)血管網(wǎng)絡(luò)吻合和與共同移植的治療細胞整合的影響，以及進一步研究孔徑大小對血管生成的作用。

文章來源：https://www.sciencedirect.com/sc ... 23005652?via%3Dihub