【文獻分享】基于黃原膠浴懸浮3D打印致密復(fù)雜組織

來源： 生物打印與再生工程

三維(3D)生物打印越來越多應(yīng)用于組裝與生物組織的組成、結(jié)構(gòu)和功能類似的結(jié)構(gòu)。在使用高密度細胞時，細胞可以在無支架環(huán)境中組裝成復(fù)雜的生理組織結(jié)構(gòu)。但是普通的打印方式無法平衡細胞密度與剪應(yīng)力值的關(guān)系，導(dǎo)致要么因為高細胞濃度產(chǎn)生的高應(yīng)力值對于細胞造成危害；要么因為低細胞濃度無法進行自組裝過程。并且3D生物打印中一般添加額外的材料，如水凝膠，以限制剪切應(yīng)力，并提高形狀保真度和分辨率。但是水凝膠油墨中可以加入的最大細胞濃度明顯低于同等組織中的濃度。此外，水凝膠成分經(jīng)常干擾細胞的自組裝過程。

為了規(guī)避這些限制，特溫特大學(xué)（UT）應(yīng)用干細胞系的Robert Passier教授團隊提出了一種簡單而廉價的嵌入式打印方法，基于黃原膠浴，使用由細胞、球體、水凝膠珠或其組合組成的稀釋顆粒懸浮液來3D打印致密的功能性線性組織。利用這種方法，Robert Passier團隊證明了功能性心臟組織纖維（心外膜細胞層圍繞著心肌細胞體）的自組織過程。

背景介紹
隨著開創(chuàng)性的研究成果展示了在散裝流體和顆粒介質(zhì)中的嵌入式打印的優(yōu)越性，引發(fā)了3D生物打印的范式轉(zhuǎn)變。嵌入式打印允許3D打印低粘度生物墨水，同時高濃度細胞懸浮液的打印在碳球顆粒浴中顯示出非常高的保真度和形狀控制。盡管已報道的嵌入式打印方法已經(jīng)清楚地展示了該技術(shù)的潛力，但大多數(shù)刊物中要么使用具有非常高細胞密度的油墨，導(dǎo)致細胞暴露于高剪切應(yīng)力值，要么導(dǎo)致具有低細胞密度的打印結(jié)構(gòu)，這可能阻礙自組裝成致密的組織結(jié)構(gòu)。在少數(shù)只使用細胞墨水的嵌入打印案例中，要么是周圍的嵌入液對細胞活力產(chǎn)生負面影響，要么是細胞與周圍環(huán)境混合并相互作用。在Brassard等人報道的唯一案例中，高細胞活力和擠壓細胞懸浮液導(dǎo)致自組裝，需要復(fù)雜的包埋浴配方和定制的擠壓設(shè)備。此外，盡管目前的數(shù)據(jù)表明細胞在打印后被包裝，但這一過程并未被描述。

本文提出了一種將稀釋水懸浮液生物打印成致密顯微組織的方法：在屈服應(yīng)力流體浴中打印液滴和線條, 從而最大限度地減少了擠出所需的壓力和油墨內(nèi)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力。油墨在黃原膠包埋液中打印(圖1(B))，之后液體從打印結(jié)構(gòu)中徑向擴散(圖1(C))。這導(dǎo)致懸浮液的液體體積分數(shù)急劇下降，從而將顆粒集中在繪制的軌跡位置。Robert Passier團隊證明，這將導(dǎo)致復(fù)雜的微組織纖維的自組裝，并且打印出的微組織纖維僅由生物鏈接的顆粒部分組成(圖1(C)和(D))。

相對于Nelson等人的工作，本文關(guān)鍵的技術(shù)調(diào)整是，本研究中使用的懸浮液由與嵌入液相混溶的液體組成。此外，生物墨水描繪了水溶液的粘度，從而最大限度地減少了擠出所需的壓力和墨水內(nèi)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力。此外，這種方法與多種球形實體兼容，包括細胞、細胞球狀體和水凝膠微珠，這有可能包括對發(fā)育組織中的受控化學(xué)或機械刺激。

圖1 打印過程

實驗結(jié)果與討論

一、打印參數(shù)優(yōu)化

（1）懸浮油墨密度調(diào)節(jié)

為了實現(xiàn)一致的油墨性能并允許相關(guān)的打印時間，在油墨中加入了密度調(diào)節(jié)劑(碘沙醇)，以保持懸浮液的均勻分布。當顆粒與介質(zhì)的密度匹配可以延長懸浮油墨的操作窗口，因為它可以防止沉降或漂浮，同時保證顆粒在液相中的均勻分散。（圖2(A)顆粒懸浮液）同時當顆粒以低體積分數(shù)(ϕp < 0.1)均勻分散在密度匹配的液相中時，顆粒不會感受到彼此的局部擾動流場，顆粒也不會顯著改變液體的流變特性。

（2）打印方向探索

通過不同的打印方向可以得到不同的結(jié)構(gòu)。將噴嘴水平移動通過黃原膠浴導(dǎo)致形成臨時溝槽，該溝槽在噴嘴通過后瞬間充滿黃原膠。被擠出的材料傾向于沿著噴嘴外側(cè)流過溝槽，形成片狀結(jié)構(gòu)。(圖2(B (i))) 而當標準噴嘴在浴槽中垂直移動時，導(dǎo)致沿噴嘴路徑打印出一條豎線。(圖2(B (ii))同時為了防止在水平位移的情況下噴嘴周圍的墨水流動，使用了90°彎曲的針打印。(圖2(B (iii)))

（3）擴散堆積現(xiàn)象

通過用染料標記油墨的液相，可以看出液相在擠出后擴散到黃原浴中，形成沿擠出路徑的濃縮顆粒物質(zhì)直線（圖2（C（i-ii）））。

（4）生物相容性

為了證明該方法的生物相容性，使用直徑約為60 μm的SMC微球在0.1 φp用作懸浮油墨的顆粒部分，將打印品系培養(yǎng)7 d，得到完全融合和致密的組織纖維（圖2（D（i-iii）））。

圖2 牛頓流體和稀釋懸浮液的嵌入式 3D 打印

二、擴散堆積的機制

（1）定制成像裝置

Robert Passier團隊準備了一個定制的成像裝置，允許在打印時對多個組分進行實時多色熒光成像(圖3 (A)和(B))。

（2）黃原膠浴與牛頓流體浴打印比較

使用這套成像裝置，可以確認當使用黃原膠浴時，擠出的材料沿著噴嘴的外部流動(圖3(B))。為了防止這種現(xiàn)象，將黃原膠浴加入2% 海藻酸鹽，使其表現(xiàn)為牛頓流體。通過對槽的這種調(diào)整，不再發(fā)生回流(圖3(B))。然而，雖然在黃原膠海藻酸鹽液中仍然可以打印懸浮液，但擴散堆積過程不再發(fā)生，而是顆粒與包埋液的近端區(qū)域混合。這表明黃原膠的剪切變薄和自愈特性對于顆粒結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要。

（3）靜態(tài)與移動噴嘴以不同注入量打印比較

在1.5%黃原膠液中，靜態(tài)(i-iii)和移動(iv-vi)噴嘴注入量為10 μl時，溢流(1 ml )、匹配流量(100 μl )和底流(10 μl )。在溢流的情況下，液體猛烈地破壞包埋槽，無論是移動的還是靜態(tài)的。當靜態(tài)時，液體沿著阻力最小的路徑沿著噴嘴表面運動，當噴嘴在擠壓過程中運動時，懸浮液堆積噴嘴體積打開的空腔。

（4）隨時間擴散堆積成像

為了確定油墨擠出速率對油墨在黃原膠浴中分布的影響，在保持噴嘴靜止的情況下，以三種不同的流速注入0.1 φp的香豆素-6 PS顆粒懸浮液，加入羅丹明B，然后在同時移動噴嘴的情況下重復(fù)不同流速的擠出打印(圖3(D))。在2ml 的高流速下，液體噴射并推開黃原膠，形成湍流區(qū)域。在中間流量為100 μl 時，觀察到先前觀察到的沿噴嘴回流行為。在10 μl 的低流速下，觀察到懸浮液緩慢進入針尖區(qū)域。在擴散圖中可以觀察到輕微傾斜，這與圖3(D (v-vi))所示90°彎曲針的輕微角度一致。這進一步證明了流入面積由噴嘴結(jié)構(gòu)決定。

圖3 擴散堆積可視化與分析

三、特征打印

為了演示除直線以外的特征的3D打印，使用含有0.1 φp Fe2O3顆粒的墨水打印了大小網(wǎng)格圖案(圖4(A))。結(jié)果表明，特征可以打印重現(xiàn)，并且相交線引起的干擾最小。此外，通過打印一系列具有不同行距的后續(xù)線條來探索打印紙張的方法(圖4(B))。當后續(xù)線的中心間距為400 μm時，可以形成可復(fù)制的薄片。較低的300 μm距離會導(dǎo)致顆粒過度堆積，形成不規(guī)則的片狀物。較高的500 μm距離會導(dǎo)致擴散堆積后的后續(xù)線之間出現(xiàn)間隙。

圖4 復(fù)雜結(jié)構(gòu)打印

四、平臺潛力

在本研究中所研究的所有油墨中，懸浮油墨的顆粒最初都是自由地流入噴嘴圖區(qū)，然后通過擴散堆積進行集中接觸，形成致密的顆粒線。海藻酸鹽顆粒和膠原顆粒線隨著時間的推移是穩(wěn)定的。CMs、IPSCs和SMC球體隨著時間的推移融合形成微組織(圖5(B) - (D))。這些組織的形態(tài)根據(jù)所使用的細胞或細胞球體的融合電位而變化。主要表現(xiàn)為：SMC球體形成了一種剛性纖維，可以用鑷子夾起(圖2(C))，這一特征也可以在其他配方中觀察到，包括iPSCs，以及SMCs與PLA顆粒的組合。在沒有細胞的情況下，顆粒保持原位。當分別測試膠原包被顆粒與SMC細胞和SMC球體的組合時，隨著時間的推移，觀察到復(fù)雜組織的自組裝。由于組織致密，線條特征轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄠�組織球，以初始細胞和球體濃度最高的區(qū)域為中心(圖5(E)和(F))。對感興趣的區(qū)域進行z堆疊成像，觀察組織結(jié)構(gòu)。這表明，細胞物質(zhì)包圍了顆粒，并將它們整合成一個復(fù)合組織。

Robert Passier團隊還測試了不同打印噴嘴的使用，與影響打印分辨率的傳統(tǒng)參數(shù)進行比較，表明使用較小的噴嘴對線條的平均特征分辨率只有邊際影響（圖5（A））。并且沿其長度改善了線寬的一致性。

五、纖維類器官的自組裝

在第3.4節(jié)中，觀察到細胞物質(zhì)融合成纖維，這可以被認為是一個自組裝過程，Robert Passier團隊假設(shè)纖維可以隨著時間的推移進一步重塑。

（1）熒光蛋白標定

為了驗證這一點，Robert Passier團隊3D打印了hpsc來源的CMs和hpsc來源的心外膜細胞系，它們都表達不同的熒光蛋白，從而可以跟蹤兩種細胞類型。hPSC-CMs表達來自NKX2.5基因組位點的GFP，并具有α - actiin - mrubyii融合蛋白。NKX2.5是一種心臟標志物，存在于心臟祖細胞和收縮的CMs中，α -肌動蛋白是CMs中收縮機制的一種肌合成蛋白(圖6(A))。通過內(nèi)源性表達COUP-TFII位點的紅色熒光mCherry，可以識別打印構(gòu)建體中的hpsc -心外膜細胞。COUP-TFII在心外膜細胞中表達，但在心室CMs中不表達(圖6(A))。

（2）隨時間形成纖維

在圖6(B)中，可以觀察到心臟/心外膜細胞結(jié)構(gòu)在3 d內(nèi)形成連接的纖維。第3天之后，纖維延長至第8天，之后纖維縮短。在細胞密度過低的位置，纖維分離成較小的細胞球體。

（3）細胞遷移

如圖6(C)所示，根據(jù)第0天細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的熒光分布，打印后細胞立即隨機分散。隨著時間的推移，細胞逐漸在纖維結(jié)構(gòu)內(nèi)遷移，在13 d的時間過程中形成雙層組織，由一層心外膜細胞覆蓋的CMs體組成，類似于人類心臟組織中的組織。

（4）肌節(jié)形成

第13天，共聚焦顯微鏡檢查肌節(jié)的形成，觀察到纖維組織內(nèi)α -肌動蛋白的均勻分布(圖6(D))。

（5）組織自發(fā)與起搏跳動

第8天觀察到自發(fā)性心跳。在心臟纖維電起搏后，組織開始同步跳動，起搏頻率可達4hz(圖6(E)和(F))。

（6）形成自發(fā)附著的組織纖維

當纖維與允許粘附的板表面接觸時，觀察到組織纖維的自發(fā)附著(圖6(G))。

圖6 心臟組織的生物打印

總結(jié)

Robert Passier團隊的方法允許簡單和廉價的3D打印稀顆粒懸浮液，自組裝形成致密復(fù)雜的組織纖維。由于不需要水凝膠相，細胞和球體很容易融合并組織成功能結(jié)構(gòu)，如跳動的心臟纖維打印圖所示。黃原膠浴可以3D打印具有定義的隔間，以空間定義的模式刺激隨后打印的組織。由于鍍液的滲透性允許液體擴散，因此可以通過在鍍液頂部添加簡單的液體來引入趨化引導(dǎo)。如心臟纖維起搏所示，機械和電刺激在培養(yǎng)過程中也是可能的。最后，這種方法是廉價的，可以很容易地適應(yīng)任何擠出式生物打印機。