“鈦”棒了！3D打印多孔重建棒改善股骨頭壞死

來源： EngineeringForLife

股骨頭缺血性壞死是一種常見的髖關(guān)節(jié)疾病。由于股骨頭血供的損傷和破壞，骨細(xì)胞和骨髓的缺血性壞死導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)的改變和塌陷。近日，來自四川大學(xué)的周長春研究員及其團(tuán)隊(duì)采用3D打印技術(shù)制備了一種負(fù)載淫羊藿苷（IC）的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒（稱為重建棒）。通過有限元分析，驗(yàn)證了重建桿的力學(xué)有效性。通過將含淫羊藿苷的硫基透明質(zhì)酸水凝膠填充到多孔結(jié)構(gòu)中，實(shí)現(xiàn)了淫羊藿苷的負(fù)載。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了重建棒的生物學(xué)功效，表明其能夠增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞粘附和擴(kuò)散。通過動物股骨頭壞死模型，在體內(nèi)驗(yàn)證了重建棒的治療效果。結(jié)果表明，重建棒促進(jìn)了成骨和新生血管，導(dǎo)致骨和種植體之間有效的骨融合。本研究為早期股骨頭缺血性壞死的治療提供了創(chuàng)新的策略。

相關(guān)研究內(nèi)容以“Icariin-loaded 3D-printed porous Ti6Al4V reconstruction rods for the treatment of necrotic femoral heads”為題于2023年8月1日發(fā)表在《Acta Biomaterialia》。

圖1 多孔Ti6Al4V重建棒的3D模型設(shè)計(jì)和功能結(jié)構(gòu)表征

優(yōu)化設(shè)計(jì)的重建棒的3D模型和實(shí)體結(jié)構(gòu)如圖1所示。重建棒的長度為30 mm，由前端和后端兩部分組成。前端為圓柱形，長20mm，直徑5mm。它由一個(gè)模擬人類松質(zhì)骨小梁的多孔金剛石單元組成，孔徑為660 μm，孔隙率為70%。后端為實(shí)心桿狀結(jié)構(gòu)，直徑呈梯度變化。其長度為10 mm，初始表面直徑為3 mm，并逐漸隨5°的梯度增加。重建棒表面覆蓋螺紋，螺釘深度1 mm，螺距1.5 mm。在其尾部，設(shè)計(jì)了與該工具相匹配的槽結(jié)構(gòu)，槽深度為5 mm，槽寬度為0.5-2.3 mm。沿著長軸方向構(gòu)建了一個(gè)穿透重建桿的圓柱形孔，直徑為2mm。

圖2 各組的有限元模型及等效應(yīng)力分布網(wǎng)絡(luò)圖

采用有限元分析（FEA）來評價(jià)重建棒的機(jī)械有效性，并采用Von-Mises等效應(yīng)力分布作為輸出。當(dāng)負(fù)荷值為體重的3倍時(shí)，健康組在植入棒前，股骨頭表面的等效應(yīng)力值在0-23.33 MPa范圍內(nèi)，遠(yuǎn)低于皮質(zhì)骨的屈服強(qiáng)度（約100 MPa）（圖2A）。重建棒的等效應(yīng)力分布在0~8.97MPa范圍內(nèi)，遠(yuǎn)低于多孔Ti6Al4V合金的屈服強(qiáng)度（約100 MPa）（圖2B）。持續(xù)的力有可能導(dǎo)致骨折的進(jìn)一步伸展，最終導(dǎo)致頸股骨完全斷裂，導(dǎo)致整個(gè)關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能的喪失（圖2C）。同時(shí)，植入多孔重建棒的等效應(yīng)力分布在安全范圍內(nèi)（圖2D)。重建桿最大等效應(yīng)力值達(dá)到118.50 MPa，超過了多孔Ti6Al4V合金的屈服強(qiáng)度，存在屈服變形和疲勞斷裂的風(fēng)險(xiǎn)（圖2E）。集中在重建桿上的當(dāng)量應(yīng)力也降低到屈服強(qiáng)度以下，以避免屈服和疲勞引起的變形和斷裂（圖2F)。各組最大等效應(yīng)力值分布的統(tǒng)計(jì)直方圖如圖2G所示，其結(jié)果呈現(xiàn)出相同的趨勢。

圖3 透明質(zhì)酸（HA-SH）水凝膠的理化表征

HA-SH通過自交聯(lián)反應(yīng)形成，在巰基之間形成二硫鍵，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖3A所示。用1H NMR驗(yàn)證了巰基的成功接枝，計(jì)算出接枝率約為34.5%（圖3B）。HA-SH水凝膠通過注射器的擠壓成型成定制的文字，反映了其可注射性能（圖3C）。各組HA-SH的凝膠化率相似，外觀透明、純度高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3D）。在膨脹實(shí)驗(yàn)中，HA-L和HA-M達(dá)到膨脹平衡的速度快于HA-H（圖3E），說明在一定范圍內(nèi)，溶質(zhì)濃度越高，吸水能力越強(qiáng)，同時(shí)溶脹比越高，越不容易達(dá)到溶脹平衡。在降解實(shí)驗(yàn)中，HA-H和HA-M達(dá)到降解平衡的速度要快于HA-L（圖3F），說明在一定范圍內(nèi)，溶質(zhì)濃度越低，降解速率越快，抗降解性越差，質(zhì)量損失比越高。儲存模量反映材料的彈性，而損失模量反映材料的粘度，HA-H的粘彈性較高，HA-M和HA-L的粘彈性較低（圖3G、H），這說明HA-SH水凝膠的粘彈性與其濃度有關(guān)。HA-SH水凝膠的粘度隨著剪切頻率的增加而降低（圖3I)，具有剪切變薄的特性，有利于其注入行為。

圖4 重建棒多孔區(qū)域各組分的示意圖和形態(tài)表征

負(fù)載淫羊藿苷的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒基于Ti6Al4V合金，多孔區(qū)域的孔隙用載淫羊藿苷的HA-SH水凝膠填充，各部件的示意圖如圖4A所示。通過3D打印制備的Ti6Al4V合金具有清晰可見、排列整齊的多孔結(jié)構(gòu)（圖4B）。HA-SH水凝膠具有不規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu)，大小分布在數(shù)十至數(shù)百微米之間，為細(xì)胞粘附和組織生長提供空間，以體液為介質(zhì)實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)和其他物質(zhì)的分子間轉(zhuǎn)運(yùn)，有利于藥物的緩慢釋放（圖4C）。IC粉末呈顆粒狀或棒狀形態(tài)，尺寸分布在幾百納米到幾十微米之間（圖4D）。

圖5 在Ti、T3-E1和Ti-HA-IC支架上培養(yǎng)的MC3T31、3、7天細(xì)胞活性和增殖

CCK-8檢測結(jié)果表明，與空白和Ti相比，Ti-HA-IC同時(shí)顯示出更多的細(xì)胞數(shù)量（圖5A），以及更快的增殖速率（圖5B）。Ti-HA-IC表面的細(xì)胞數(shù)量較多，具有一定的分布規(guī)律，勾勒出了支架的多孔結(jié)構(gòu)。共培養(yǎng)第7天，兩種支架表面的細(xì)胞密度均顯著增加，且分布規(guī)律相似。相比之下，在Ti-HA-IC表面，細(xì)胞數(shù)量更多，細(xì)胞分布更密集，細(xì)胞勾畫出的多孔結(jié)構(gòu)更清晰（圖5C），證明兩種支架均具有細(xì)胞相容性。

圖6 在Ti和Ti-HA-IC支架上培養(yǎng)的MC3T3-E1在第7天的細(xì)胞分布形態(tài)

圖6A-F為鬼筆毒環(huán)肽/DAPI染色下不同密度分布區(qū)域細(xì)胞的CLSM圖像及細(xì)胞平均擴(kuò)散面積的半定量結(jié)果，結(jié)果均顯示Ti-HA-IC支架上的細(xì)胞平均擴(kuò)散面積高于Ti支架。圖6G-L為不同表面區(qū)域細(xì)胞的掃描電鏡（SEM）圖像以及細(xì)胞平均擴(kuò)散面積的半定量結(jié)果，結(jié)果顯示Ti-HA-IC支架上的細(xì)胞平均擴(kuò)散面積高于Ti支架（白色箭頭指向具有代表性的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)）。綜上結(jié)果，當(dāng)IC以一定濃度裝入支架時(shí)，支架呈現(xiàn)細(xì)胞相容性，促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞在支架上的粘附和擴(kuò)散。

圖7 無血管壞死（AVN）的體內(nèi)和體外建模及其特性研究

在體外實(shí)驗(yàn)中，建模后股骨頭出現(xiàn)明顯的凍傷特征，再升溫后較長時(shí)間無法恢復(fù)，提示存在不可逆的壞死過程（圖7A）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，HE染色顯示骨清晰，結(jié)構(gòu)致密有序，建模前骨細(xì)胞表型正常（圖7B）。建模后，骨結(jié)構(gòu)溶解，骨小梁排列紊亂（圖7C）。MRI信號異常是骨壞死早期診斷的一個(gè)敏感特征，股骨頭的高信號和低信號混合，呈“圖型”和“雙線征”（圖7D）。這些結(jié)果證實(shí)了AVN的發(fā)生。X射線顯示股骨頭在未植入重建棒的情況下，基本表現(xiàn)出加重壞死的趨勢；植入重建棒，股骨頭的整體形狀和生理結(jié)構(gòu)沒有明顯變化，關(guān)節(jié)空間清晰，灰色值密度均勻分布，沒有明顯的不規(guī)則變化，沒有明顯的特點(diǎn)AVN如脆性骨折、增生和崩潰（圖7E）。未植入重建棒，術(shù)后第16周觀察到股骨頭出現(xiàn)典型的壞死表現(xiàn)；相比之下，重建棒的股骨頭有光澤，形狀正常，高度球形（圖7F）。

圖8 采用Micro-CT觀察術(shù)后16周股骨頭骨量和骨形態(tài)

如圖8A所示，重建各組股骨頭3D模型（包括重建棒），觀察宏觀形態(tài)（黃色），重建各組ROI骨3D模型（紅色半球形區(qū)域），觀察輪廓結(jié)構(gòu)（灰色）。骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）可以直接反映骨量的變化，結(jié)果顯示，Ti-HA-IC組的值與健康組的值相近，而Ti組的值略低，對照組的值最低（圖8B)。骨表面積密度（BS/TV）可以間接反映骨量的變化，結(jié)果顯示Ti組的值與健康組值接近，而對照組和Ti-HA-IC組的值明顯下降（圖8C)。為了進(jìn)一步分析Ti-HA-IC組中較低的BS/TV值，采集各組中具有代表性的冠狀面灰度值圖像進(jìn)行比較，與其他各組相比，Ti-HA-IC組的骨分布較密集，骨小梁間的間隙較小，沒有明顯的低密度區(qū)域（圖8D）。同時(shí)在每張圖像中選擇重建棒前端股骨頭的中心位置，計(jì)算指定區(qū)域（紅色圓圈中）的平均灰度值，并繪制成折線圖，其中Ti-HA-IC基團(tuán)的數(shù)值計(jì)算結(jié)果最好（圖8E）。通過血管造影重建Ti組和Ti-HA-IC組股骨頭周圍血管的3D模型，Ti-HA-IC組的血管分布密集，數(shù)量較多，主血管均較粗，新生毛細(xì)血管也較�。▓D8F）。通過統(tǒng)計(jì)值比較，Ti-HA-IC組股骨頭周圍血管的體積和面積均大于Ti組（圖8G）。這說明Ti-HA-IC組IC的持續(xù)釋放同時(shí)促進(jìn)了骨和血管的修復(fù)和再生，血管的形成進(jìn)一步加速了骨的形成，為AVN提供了協(xié)同治療。綜上所述，負(fù)載淫羊藿苷的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒對AVN的修復(fù)和治療效果最好。



圖片

圖9 采用HE染色和熒光法檢測術(shù)后第16周時(shí)股骨頭的新骨形成和骨小梁形態(tài)

HE染色結(jié)果如圖9A、B所示，其中股骨頭骨與重建棒接觸位置（或同等位置）的代表性圖像如圖9A所示，重建棒前部位置（或同等位置）的代表性圖像見圖9B。骨小梁形狀較厚，整體分布密度較高，呈塊狀分布特征。半定量結(jié)果顯示，各組間骨面積比例有一定程度的差異（圖9C）。在Ti組和Ti-HA-IC組中，整體上沒有明顯的骨丟失，半定量結(jié)果顯示與健康組相比，對照組骨面積比例明顯減少，Ti組無顯著差異，Ti-HA-IC組骨面積比例顯著增加（圖9D）。這些結(jié)果表明，如果不進(jìn)行及時(shí)的干預(yù)和有效的治療，股骨頭壞死的影響范圍將會逐漸增大。通過熒光標(biāo)記技術(shù)比較了對照組和Ti-HA-IC組在新骨生長方面的差異（圖9E）。在圖像中，鈣黃綠素標(biāo)記的熒光為綠色，鹽酸四環(huán)素標(biāo)記為紅色，兩者的一致性為橙色。在對照組中，兩種熒光軌跡重疊很多，說明新骨生長緩慢甚至停止。在Ti-HA-IC組中，兩個(gè)熒光軌跡明顯分離，表明在負(fù)載淫羊藿苷的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒的作用下，新骨仍在生長。

綜上所述，本研究開發(fā)了一種負(fù)載淫羊藿苷的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒，為維持股骨頭功能結(jié)構(gòu)提供機(jī)械支持，釋放IC，促進(jìn)骨修復(fù)和再生，實(shí)現(xiàn)機(jī)體與種植體的有效整合。有限元分析結(jié)果表明，植入的重建棒可以轉(zhuǎn)移骨壓迫，可以有效地支撐負(fù)荷和維持股骨頭的結(jié)構(gòu)和功能。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，負(fù)載IC支架促進(jìn)了MC3T3- E1細(xì)胞的增殖，有利于細(xì)胞在支架上的粘附和擴(kuò)散。體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在AVN早期植入的重建棒既為股骨頭提供了機(jī)械支持，也為新骨的生長提供了有利的環(huán)境，從而形成了有效的界面整合。此外，IC的持續(xù)緩慢釋放進(jìn)一步促進(jìn)了新骨和血管的再生，導(dǎo)致股骨頭骨量和骨密度的增加，對壞死的治療有積極的作用。因此，本研究為AVN的早期治療提供了一個(gè)潛在的策略。


文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.07.057