改改交聯策略！3D打印海藻酸鈉生物墨水發(fā)了《Biofabrication》

來源： EngineeringForLife

生物打印是一種制造具有可控幾何形狀充滿細胞體積結構的關鍵技術。不僅可以用來復制目標器官的結構，還可以用來形成形狀，以便在體外模仿特定的理想特征。在適合用這種技術處理的各種材料中，海藻酸鈉因其多功能性而被認為是目前最有前景的材料之一。到目前為止，最廣泛打印海藻酸鈉生物匯的策略是利用外部凝膠化作為主要過程，通過直接將水凝膠前體溶液擠壓到交聯浴中或在交聯水凝膠中發(fā)生凝膠化。近日，來自意大利米蘭理工大學的Paola Petrini教授團隊進行了內部交聯藻酸鹽基生物墨水制備體外肝組織模型的相關研究。研究成果以“Internally crosslinked alginate-based bioinks for the fabrication of in vitro hepatic tissue models”為題于5月24日發(fā)表在《Biofabrication》上。

本文研究了Hep3Gel的打印優(yōu)化和加工：一種內部交聯的海藻酸鹽和ECM為基礎的生物墨水，用于生產大體積的肝臟組織模型。本文采取了一種非常規(guī)的策略，從再現肝臟組織幾何形狀和結構轉向使用生物打印來制造能夠促進高度氧合的結構，如肝臟組織情況一樣。為此，通過采用計算方法對結構設計進行優(yōu)化。然后通過不同先驗和后驗分析組合，研究和優(yōu)化了生物墨水的可打印性。制作了14層結構，從而突出了利用內部凝膠化直接打印具有精細控制粘彈性能的自立結構的可能性。裝有HepG2細胞的結構成功打印出來，并在靜態(tài)條件下培養(yǎng)了12天，證實Hep3Gel支持中/長期培養(yǎng)的適宜性。

1. 3D生物打印增強氧擴散數值模擬

圖1 通過結構氧擴散的數值模擬

進行3D生物打印增強氧擴散的數值模擬，評估以設計幾何為特征的靜態(tài)培養(yǎng)結構可以達到的氧合程度。將這些結果與通過靜態(tài)培養(yǎng)結構獲得的結果進行比較，結構的特點是整個結構具有零孔隙度水平。在這些模擬中，30分鐘后達到平衡。過渡階段（從0分鐘到30分鐘）的分析顯示了兩種幾何形狀之間的顯著差異并強調采用大孔結構有利于構建體的氧合。相反，無孔支架的特點是氧合的梯度從外圍到中心不斷下降。從數量上看，一旦達到平衡，大孔的幾何形狀比無孔的幾何結構的氧合度高3-4倍。在30分鐘內成功建立了均勻的氧合度，構建體中的O值與新鮮培養(yǎng)基中的O值相同，驗證了設計的幾何形狀。有鑒于此，打印的工程生物匯將圍繞這一特定形狀進行優(yōu)化。

2. Hep3Gel粘彈性能和微觀結構隨時間變化

圖2 Hep3Gel和對照材料的粘彈性能及微觀結構隨時間變化情況

Hep3Gel和控制材料的隨時間變化的粘彈性能以下列方式進行分測量的，保守模量（G）和損失模量（G"）是在水凝膠交聯過程中進行。掃頻試驗的結果表明在所檢查的時間點上，Hep3Gel、GEL和ALG樣品已經越過了凝膠點，它們的保守模量G大于它們的損失模量G"。也可以觀察到粘彈性能的變化，G'隨著時間的推移而增加而損失模量G"幾乎沒有變化。在每個被檢查的樣品中逐漸減少也突出了這種特性。通過應用廣義麥克斯韋模型得到的數據清楚表明，網目尺寸(即兩個相鄰交聯點之間的平均距離）隨著時間的推移而減少。這一趨勢在GEL和ALG樣品中幾乎不明顯，但在Hep3Gel中則明顯得多。

3. 打印參數的優(yōu)化

圖3 通過流變學分析對可打印性能進行評估

Hep3Gel、GEL和ALG的粘彈性能總體趨勢是一致的。GEL和ALG有著極其相似的交聯動力學。在交聯開始后約1小時達到凝膠點。在不同的是，在Hep3Gel的情況下，凝膠化的進展延遲，從"溶膠"到"凝膠相"的過渡是在從反應開始大約2小時后達到。此外，在24℃和37℃下，G'和G"的測量結果沒有明顯差異。表明了在所考慮的溫度范圍內，水凝膠的粘彈性行為是獨立于溫度的，在生產GEL所采用的濃度下，明膠對交聯網的結構沒有貢獻。一般的次級相互作用會受到受溫度變化的影響。所有水凝膠的粘彈性能與溫度無關。剪應力振幅掃描（屈服測試）的數據表明在每個時間點，對于所有的材料，都有一個確定的剪切應力振幅，在這個振幅上，G"開始超過G'。表明在這種應力下，材料開始表現得像流體而不是固體。另一方面，恢復試驗表明，在每個檢查的時間點、Hep3Gel和對照材料都能或多或少地逐步恢復其原有的粘彈性能。

4. 打印參數優(yōu)化與交聯動力學關系

圖4 用22G圓柱形針進行的可打印性分析

最小擠出壓力，定義為沸點的長絲可以連續(xù)擠出的最小壓力，Hep3Gel和對照材料都有類似的隨時間變化的趨勢。然而，雖然GEL和ALG顯示出相似的數值，開始交聯后，Hep3Gel在早期階段的最低擠出壓力較低、并逐漸變得與對照組的壓力更相似。形狀保真度結果的多參數分析表明，對于所研究的應用，可打印性系數P逐漸接近對照組。從交聯開始的24小時后，與單位值的差異達到最小。并且可打印性的值和孔隙系數之間有定性的聯系�；�于這些結果，打印所檢查尖頭的最佳時間點是從交聯開始的24小時。有可能為每種材料確定最有效的噴頭速度和擠壓壓力組合。無論是圓柱形還是錐形配置。使用22G針頭打印時獲得的數據顯示圓柱形和錐形針在最小擠出壓力方面的一致差異。

5. 通過外部凝膠化使打印出的構建體穩(wěn)定

圖5 打印后流變性能和后處理流程

接著進行流變分析以了解擠壓過程是否以及如何損害尖頭的粘彈性能。在打印之后，所有材料粘彈性能最多下降25%。盡管如此，彈性模量G'仍然高于粘性模量G"，表明材料在擠壓過程中受到的沖擊并沒有導致它們從凝膠階段過渡到溶膠階段。此外，在這個時間點上，打印出來的構建體很脆弱，不可能在不損壞的情況下處理。構建體制造45分鐘后進行的測試表明，原始的流變特性得到了恢復、從而重申了Hep3Gel和對照組水凝膠的自我修復行為。在這個時間點，打印的構建體可以更容易處理，而不會斷裂。然而，由于這種延遲可能會影響嵌入細胞的存活。通過研究不同濃度CaCI2溶液的影響，目的是為了彌補這種在粘彈性能方面的暫時差距。在不同濃度的CaCI2中，發(fā)現0.1%的CaCI2和0.5%的CaCI2都可以使用。這個過程并沒有導致打印結構收縮，其形狀在培養(yǎng)條件下保持穩(wěn)定達12天之久，與形狀和孔隙度的尺寸沒有明顯的差異。

6. 裝有HepG2細胞生物打印構建體靜態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)

圖6 HepG2細胞生物活性狀態(tài)分析

用Hep3Gel制作的構建體，定量分析發(fā)現有活力的細胞顯著增加。從第6天開始，細胞開始持續(xù)增長，在第12天超過200%的存活率。這一趨勢在對照材料中沒有發(fā)現，細胞活力在整個實驗過程中基本保持不變。在Hep3Gel的情況下，從最初時間點到最后的時間點都可以觀察到綠色熒光強度的增加。對照材料則沒有觀察到這種增加。無論是在Hep3Gel還是在控制材料中，紅色熒光強度均沒有增加。

7. 總結與展望

內部凝膠化是一種優(yōu)異的方法，可以克服兩個基于擠壓海藻酸鹽生物打印的主要問題。首先，打印出來的支架最終粘彈性能是完全可控的，并且可以進行微調。也避免了不希望和不可控的交聯梯度形成。此外，這種方法還可以制造自立結構、不需要將海藻酸鹽與其他材料混合，以提高結構的完整性。本文提出了一種直接的方法來優(yōu)化這種類型的生物墨水打印能力。證明Hep3Gel和控制材料不適合于反應性生物打印。所提出的方法適合于優(yōu)化打印參數，以制造所設計的構造�？稍试S打印14層自立結構，并且保持預先確定的粘彈性能。采用大孔3D生物打印的幾何形狀導致更高和均勻的氧合水平、甚至在構建體的核心區(qū)域。與在均勻水凝膠上進行的研究相比，這使得我們的培養(yǎng)時間延長了50%。進一步的研究應該集中在采用這個過程制造和培養(yǎng)構建物，嵌入更多的代謝相關細胞類型對本文提出的模型進行驗證。

文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acd872