受齒輪形狀啟發(fā)的3D 打印生物支架：用于免疫調節(jié)和骨再生

來源：EngineeringForLife  

免疫調節(jié)和成骨微環(huán)境對骨組織的三維再生具有重要意義。三維支架具有不同的化學成分、大孔結構和表面特征，為骨組織再生提供了有利的微環(huán)境。然而，生物陶瓷支架有序的表面微結構與骨再生的免疫微環(huán)境之間存在差距。在這項研究中，中國科學院大學上海硅酸鹽研究所吳成鐵課題組等通過一種改進的基于擠出的3D打印策略，成功地制備了具有良好表面微結構的齒輪啟發(fā)的3D支架，用于免疫調節(jié)和骨再生。制備的齒輪支架可誘導巨噬細胞向M2表型極化以減輕炎癥，進一步促進骨髓間充質干細胞成骨分化以形成新骨。在骨組織工程和再生醫(yī)學的免疫調節(jié)和成骨微環(huán)境中發(fā)揮著關鍵作用。相關研究 “3D Printing of Gear-inspired Biomaterials: Immunomodulation and Bone Regeneration”于2022年9月12日發(fā)表在雜志《Acta Biomaterialia》上。  

研究表明，具有免疫調節(jié)特性的生物材料可以誘導巨噬細胞的適當反應，從而釋放細胞因子，促進骨髓間充質干細胞的成骨分化，最終促進新骨形成。因此，構建免疫調節(jié)性和成骨微環(huán)境對骨組織的三維再生具有重要意義。本文通過改進的3D打印技術成功地制備了具有良好表面微結構的齒輪狀3D生物陶瓷支架，用于系統(tǒng)地調節(jié)骨組織工程領域中的免疫和成骨微環(huán)境。

1. 不同齒輪狀結構的設計與制備
為了在生物陶瓷支架上構建齒輪啟發(fā)的微結構，使用改進的基于擠壓的3D打印技術的噴嘴設備，圖1為齒輪狀支架及其制造設備的示意圖和實物圖。

圖1 改進型噴嘴和齒輪式支架的形態(tài)

2. 基于齒輪結構的生物陶瓷支架的三維打印與表征
為了探索齒輪狀生物陶瓷支架表面微結構的生物學功能，制備了兩個不同系列的結構變量(不同溝槽寬度或深度)的齒輪生物陶瓷支架(圖2A)。以沒有任何齒輪微結構的普通支架 (光滑) 作為對照材料 (圖2A) 。為了進一步驗證這種改進的3D打印技術的普適性，成功地制備了不同微觀結構(圖2B)、不同原材料 (圖2C) 和內槽結構 (圖2D) 的支架。由于β-磷酸三鈣(β-TCP)具有良好的生物相容性、成骨性能和廣泛的臨床應用前景，本研究以其為主要基質材料。

圖2 各種齒輪啟發(fā)的支架的形態(tài)

3. 受齒輪啟發(fā)支架的體外生物學評價
已經證明，微尺度的形態(tài)對細胞的行為和命運有影響。在此，研究了不同齒輪狀生物陶瓷支架對RAW267.4細胞的免疫調節(jié)活性以及這些支架對RBMSCs的成骨活性。如激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)圖像所示，齒輪生物陶瓷支架分別對RAW264.7細胞(圖3A)和RBMSCs(圖3B)表現(xiàn)出不同的作用。結果表明，盤狀組件的溝槽寬度為20μm (G20) 時，支架對上述細胞具有最好的延伸性和定向效果。采用CCK-8法檢測細胞在齒輪啟發(fā)支架上的增殖活性。如圖3C和D所示，所有支架都表現(xiàn)出較好的生物相容性，可以顯著促進RAW264.7細胞的增殖，而RBMSCs的增殖活性略低于對照組。

圖3 RAW264.7細胞和RBMSCs在不同齒輪狀支架上的形態(tài)和增殖情況

為了探討齒輪生物陶瓷支架的免疫調節(jié)特性和成骨特性，進行了實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)實驗。將RAW264.7細胞負載于不同齒輪的生物陶瓷支架上，孵育2天。如圖4A和圖B所示，白細胞介素18(IL-18)的表達在G20組顯著下調。誘導型一氧化氮合酶(INOS)在G20組表達下調，除促炎基因外，還檢測到抗炎基因精氨酸酶-1(Arg-1) 的表達僅在G20組顯著上調。白細胞介素1受體拮抗劑(IL-1ra)的表達在G20組明顯上調。以上結果表明，G20的抗炎效果最好，且穩(wěn)定。為了進一步研究齒輪生物陶瓷支架的成骨性能，將RBMSCs種植在不同的支架上，培養(yǎng)7d。成骨相關基因的表達如圖4C和D所示。骨鈣素(OCN)基因在G20組的表達明顯高于對照組，表明具有相當的成骨活性。

除了RAW264.7細胞和RBMSCs的單一培養(yǎng)外，還建立了共培養(yǎng)體系，以探討齒輪生物陶瓷支架的免疫調節(jié)作用。以G20支架為實驗組，選擇光滑支架為對照組。如圖4E所示，將裝有RAW264.7細胞的光滑支架或G20支架放置在Transwell小室中，同時將RBMSCs種植在平板上。共培養(yǎng)2天后，實驗組RBMSCs OCN、骨橋蛋白(OPN)、Runt相關轉錄因子2 (RUNX2) 和BMP-2的基因表達水平顯著高于對照組(圖4F)，表明齒輪狀生物陶瓷支架上的RBMSCs與RAW264.7共培養(yǎng)能有效促進成骨分化。

圖4 齒輪狀支架免疫調節(jié)性能和成骨性能的體外生物學評價

4. 受齒輪啟發(fā)支架的體內生物學評價
為了進一步研究齒輪生物陶瓷支架的體內抗炎和成骨性能，建立了小鼠皮下植入模型和兔股骨骨缺損模型。選擇空白、光滑和G20三組進行研究。如圖5所示，空白組幾乎沒有炎癥反應。此外，與光滑組相比，G20組齒輪式生物陶瓷支架能促進結締組織和血管進入支架內腔。

圖5 齒輪支架免疫調節(jié)特性的體內生物學評價

在建立小鼠皮下植入模型的基礎上，建立兔股骨缺損區(qū)模型，研究齒輪激勵生物陶瓷支架的體內成骨能力。手術8周后，所有的兔都被安樂死，并采集樣本進行進一步的評估(圖6A)。如圖6B所示，相比于空白組，G20組支架(紅色)內部有更多的新生骨(綠色)。Micro-CT統(tǒng)計分析顯示，G20組的骨體積/總體積(BV/TV)值顯著高于空白組和光滑組(圖6C)。

圖6 齒輪狀支架成骨性能的體內生物學評價

此外，Van-Gieson染色顯示G20組新生骨(紅色)多于空白組和光滑組(圖7)。VG染色切片中新生骨面積的定量分析也表明，G20組的成骨性能好于空白組和光滑組。

圖7 新生骨的Van-Gieson染色(紅色)

綜上所述，通過基于擠壓的3D打印策略，成功地制備了具有不同齒輪結構的生物陶瓷支架。3D打印策略在組織工程和再生醫(yī)學的許多領域展示了多功能性和潛力。此外，齒輪狀生物陶瓷支架在體外和體內都表現(xiàn)出良好的免疫調節(jié)和成骨活性。該研究提出了一種制造齒輪生物陶瓷支架的有前景的策略，將免疫和成骨微環(huán)境整合到三維有序微結構中，有望用于免疫調節(jié)和骨組織工程。

文章來源：
https://www.sciencedirect.com/sc ... 22005694?via%3Dihub