電流體直寫載細胞纖維技術，直接將負載活細胞打印在定向的微尺度纖維中

來源： EngineeringForLife  

骨骼肌在人體的運動和其他動態(tài)活動中起著至關重要的作用。為了治療關鍵的容積性肌肉缺損，現有研究使用自體肌肉組織植入物和手術移除壞死或受損肌肉組織以增強愈合潛力。然而，由于骨骼肌在生理學上具有一種肌肉纖維束和血管平行排列的結構，由于肌纖維結構組織和相關血管形成的可控性有限，導致再生效率低，傳統(tǒng)治療往往無效。

為此，來自Sungkyunkwan University的GeunHyung Kim課題組提出一種電流體直寫載細胞纖維技術，可以直接將負載的活細胞打印在定向的微尺度纖維中，誘導成肌細胞沿打印方向生長，相關論文：Electrohydrodynamic-direct-printed cell-laden microfibrous structure using alginate-based bioink for effective myotube formation發(fā)表于Carbohydrate Polymers。

本研究展示了一種基于海藻酸鹽的生物墨水和新的生物制造方法，以獲得具有機械穩(wěn)定性和可定向的微纖維狀載細胞復合結構，可有效地誘導骨骼肌組織工程，用于芯片肌肉或恢復體積肌肉缺損的結構。

首先研究人員設計了一種帶輔助電極的噴嘴，相比單一針尖具有更均勻分布的電場。打印材料采用由C2C12載于成肌細胞的海藻酸鹽/PEO/纖維蛋白生物墨水組成，在合適的電直寫打印條件下噴射載細胞水凝膠并沉積在接地板上，組成設計的載細胞微纖維結構，如圖1。

圖1 A）噴嘴電場模擬；B）載細胞電直寫凝膠纖維過程

為了順利進行電直寫打印，研究人員對不同組分的生物墨水進行了評估，并最終確定合適的組分配比，纖維狀態(tài)穩(wěn)定并且直徑在20μm以內，如圖2。

圖2 混合不同纖維蛋白組分的生物墨水的各項性能指標

研究人員進一步探索適合的打印參數，包括施加的電場、噴嘴距離、打印速度，各項參數的影響結果如圖3。最終選擇電場強度為0.15kV/mm，噴嘴距離45mm，打印速度40mm/s的參數來制備載細胞微纖維支架。

圖3 各類參數下的電直寫效果

為對比電直寫載細胞纖維與傳統(tǒng)的細胞靜電紡絲，研究人員測試了生物墨水在不同電場強度下的細胞活力，如圖4。根據實驗結果，0.15 kV/mm的電場可以使細胞保持較高存活率，并且纖維成型較好，因此選擇該參數制備單軸排列的載細胞微纖維結構。對比傳統(tǒng)細胞靜電紡絲，電直寫能更好地在指定部位沉積，減少損耗，并且由于纖維沉積密集，電直寫纖維的細胞數量明顯高于傳統(tǒng)細胞靜電紡絲。另外，在細胞活力、細胞增殖率上，電直寫纖維都要優(yōu)于細胞靜電紡絲，力學性能也更接近天然肌肉特性。

圖4 電直寫細胞纖維與傳統(tǒng)細胞靜電紡絲對比。A）細胞存活率；B)掃描圖像；C)纖維直徑；D)細胞數量；E)細胞增殖率；F)力學性能

研究人員進一步對比了傳統(tǒng)擠出式生物3D打印、傳統(tǒng)細胞靜電紡絲、電直寫載細胞纖維在體外的細胞表征，結果如圖5。擠出式生物3D打印纖維上肌球蛋白重鏈（MHC）的形態(tài)是隨機的；而傳統(tǒng)細胞靜電紡絲和電直寫載細胞纖維則由于超細纖維形態(tài)而呈現出定向排列。但是排列的細胞只覆蓋在傳統(tǒng)靜電紡絲組的表面，而細胞在電直寫纖維上以束狀相互連接。這種有效的細胞排列可以同時具有高細胞密和適當的機械性能，并具有定向性能。其他的定量結果也表明電直寫載細胞纖維有利于成肌細胞的排列和分化，促進了肌源性分化和成熟肌管。因此，研究人員使用電直寫載細胞纖維進行C2C12成肌細胞與HUVECs的共培養(yǎng)。

圖5 傳統(tǒng)擠出式生物3D打印、傳統(tǒng)細胞靜電紡絲、電直寫載細胞纖維在體外的生物性能表征

接下來研究人員對HUVECs負載結構對共培養(yǎng)結構致肌活性的影響進行了研究，圖6。結果證實C2C12與HUVECs共培養(yǎng)有利于肌肉組織再生。在使用C2C12和HUVECs制備復合纖維結構之前，測試了HUVECs在電直寫工藝下的細胞活力和纖維形態(tài)(0.09-0.21 kV/mm)，根據結果，最終選擇了0.15 kV/mm的參數來制作載HUVECs的纖維結構。

圖6 (A) C2C12和HUVEC共培養(yǎng)染色圖像。(B) 共培養(yǎng)細胞的相對基因表達。(C) 0.09-0.21 kV/mm電場制備的HUVEC負載纖維原位活/死圖像

如圖7(a)所示，制備了負載HUVECs的電直寫載細胞纖維(HUVEC-EDF)，如圖7（A），這表明該制備工藝和微環(huán)境可以支持HUVECs生長。然后制備了負載C2C12的纖維(C2C12- EDF)和負載C2C12/ HUVECs的復合纖維(CH-EDF)，并比較了體外細胞活性，圖7（C）。根據相關細胞因子的表達檢測結果分析，由于生物物理和生化信號的協(xié)同作用，負載C2C12/ HUVECs的微纖維復合物結構能夠高效地再生肌肉組織。

圖7 負載HUVECs、負載C2C12、復合纖維成肌效果對比

最后，為了評估肌肉缺損的再生能力，如圖8，采用電直寫載細胞纖維工藝，用脂肪干細胞(ASCs)和HUVECs構建肌肉結構（AH-FS）。使用GelMA和3D打印工藝作為對照，制造載ASC的常規(guī)結構（A-CS）。經過對比，AH-FS組顯著誘導肌再生，這些在體內的結果代表了細胞負載纖維結構治療容積性肌肉損失（VML）的潛力。

圖8 脛骨前肌(TA)缺損及再生結構植入示意與對比結果

總結，該研究提出了一種新的電直寫載細胞水凝膠纖維的工藝，能夠制造高度定向的含細胞微纖維。與細胞靜電紡絲工藝不同，該方法提供了具有合理力學性能和較高細胞密度的微纖維結構，成功實現了顯著的細胞生長和肌源性分化。該研究揭示了一種新的電流體動力打印的可能性，制造具有定向效果的細胞負載微纖維結構，用于肌肉組織再生。

參考文獻
Miji Yeo, GeunHyung Kim, Electrohydrodynamic-direct-printed cell-laden microfibrous structure using alginate-based bioink for effective myotube formation, Carbohydrate Polymers
https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2021.118444