超短激光脈沖實(shí)現(xiàn)選擇性單細(xì)胞生物打印

來源：EngineeringForLife

組織工程需要將哺乳動(dòng)物細(xì)胞和生物材料精確打印在目標(biāo)基底表面或者經(jīng)預(yù)處理的支架上。近年來，已有幾種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)。其中基于噴墨和滴注的方法能以單細(xì)胞精度將活細(xì)胞進(jìn)行打印，但其準(zhǔn)確性不高且會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。另一類基于聲學(xué)的細(xì)胞圖案化技術(shù)可以同時(shí)對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行高空間分辨率的打印，并保證細(xì)胞活性，但做不到選擇性地操作單個(gè)細(xì)胞。目前缺少能夠識(shí)別并選擇單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在保證生存率的條件下對(duì)其進(jìn)行快速準(zhǔn)確打印的技術(shù)。

近期，慕尼黑應(yīng)用科技大學(xué)激光中心的Heinz P. Huber教授團(tuán)隊(duì)在Advanced Functional Materials上發(fā)表了題為Single Cell Bioprinting with Ultrashort Laser Pulses的文章。該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于超短近紅外（NIR）激光脈沖技術(shù)的生物打印方法。該方法可以根據(jù)細(xì)胞形態(tài)或熒光從混合細(xì)胞群中選擇單個(gè)細(xì)胞，并以單細(xì)胞精度和高存活率將其打印到2D目標(biāo)基底或預(yù)處理過的3D支架上。

圖1 打印設(shè)備原理和細(xì)胞打印演示

該團(tuán)隊(duì)首先集成了利用激光實(shí)現(xiàn)細(xì)胞打印的LIFT技術(shù)和倒置光學(xué)顯微鏡，從而實(shí)現(xiàn)能在水平方向上觀察細(xì)胞，并以細(xì)胞形態(tài)差異或熒光從細(xì)胞群中對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行選擇（圖1a）。其中激光波長(zhǎng)為1030nm，該波長(zhǎng)幾乎不會(huì)被細(xì)胞或其他生物材料吸收，但聚焦在水溶液中可以導(dǎo)致光學(xué)擊穿，從而形成一個(gè)迅速膨脹的氣泡，并產(chǎn)生水凝膠射流。將該激光以3uJ、600fs的脈沖聚焦在細(xì)胞下方約70μm深度時(shí)，可以將半徑約25μm范圍內(nèi)的一個(gè)或若干細(xì)胞從水凝膠中的細(xì)胞群中射出并打印到基底上（圖1c）。

圖2 a）熒光標(biāo)記細(xì)胞、無標(biāo)記細(xì)胞和無細(xì)胞狀態(tài)的打印過程；bcd）激光聚焦有橫向偏移的打印過程

然后，該團(tuán)隊(duì)又將倒置顯微鏡換成了直立式，并在豎直平面方向上增設(shè)了一臺(tái)光學(xué)顯微鏡，用于觀察載單個(gè)細(xì)胞的水凝膠液滴的打印過程（圖1b）。圖2a是激光脈沖聚焦于52μm深度，在細(xì)胞被熒光標(biāo)記、細(xì)胞沒有被熒光標(biāo)記和無細(xì)胞的條件下分別拍攝的熒光圖像，整個(gè)射流過程沒有抖動(dòng)，可以表明該方法具有很高的重現(xiàn)性和魯棒性。圖2b和2c分別是聚焦脈沖具有0μm、25μm和50μm的橫向偏移時(shí)從水平和豎直平面上觀察到的人腱干/祖細(xì)胞（hTSPC）射流的過程。在x=0μm時(shí)細(xì)胞位于水凝膠射流的尖端，x=25μm時(shí)細(xì)胞位于水凝膠射流80%的高度處，x=50μm時(shí)細(xì)胞位于更粗且速度更慢的第二射流中，當(dāng)聚焦深度更深時(shí)，第二射流會(huì)不具備足夠能力將細(xì)胞送到目標(biāo)基底上。

圖3 a）打印精度測(cè)試；b）單hMSC打印過程；cd）熒光標(biāo)記分類打��；ef）3D結(jié)構(gòu)打印

為了研究打印精度，該團(tuán)隊(duì)分別以50、100和200μm的間隔打印了一行人類間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC），可見大多數(shù)細(xì)胞的偏移量小于一個(gè)細(xì)胞直徑（約為14～32μm）（圖3a）。為了研究打印后的細(xì)胞生存率，該團(tuán)隊(duì)將hTSPC打印在涂有膠原蛋白的基底上，66小時(shí)后觀察到所有細(xì)胞仍有遷移行為，該試驗(yàn)細(xì)胞存活率100%。在15組打印人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞（TPC1）的實(shí)驗(yàn)中得到了98.5±0.4%的存活率，在13組打印B16F1細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中得到了96.5±0.7%的存活率，于其他采用LIFT技術(shù)的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相當(dāng)。圖3b是依次將五個(gè)hMSC打印在交聯(lián)牛血清白蛋白（BSA）支架的過程。圖3c和d展示的是將GFP標(biāo)記的hMSC和橙色熒光標(biāo)記的TPC1從混合細(xì)胞群中分類打印到基底上。

為了證明該設(shè)備可以擴(kuò)展到打印3D結(jié)構(gòu)，該團(tuán)隊(duì)用水凝膠Pluronic F-127向目標(biāo)基底打印了五層600μm×120μm的線（圖3e和f）。其中水凝膠Pluronic F-127被稀釋到了15wt%，并在4℃下進(jìn)行打印。打印到基底上后，水凝膠恢復(fù)室溫（22℃），粘度改變并最終形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

綜上所述，超短激光脈沖打印方法可以從混合細(xì)胞群中選擇單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以單細(xì)胞精度和93%-99%的存活率將其打印到目標(biāo)基底或經(jīng)預(yù)處理的支架上。該技術(shù)目前限于人工搜索和選擇細(xì)胞，打印單次耗時(shí)約20s（細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)間小于100μs），結(jié)合自動(dòng)化圖像分析和細(xì)胞識(shí)別軟件后可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化打印，大大提高可用性。由于該方法能夠快速、準(zhǔn)確、高存活率地打印細(xì)胞，可以應(yīng)用于制造細(xì)胞芯片、器官芯片、三維類器官等。

論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202100066