3D打印仿哈弗斯骨結(jié)構(gòu)——仿生細(xì)胞再生

來源：增材之光

近日，中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所吳成鐵研究員與常江研究員帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)在3D打印仿哈弗斯骨結(jié)構(gòu)生物陶瓷支架用于多細(xì)胞遞送和骨組織再生方面取得新進(jìn)展。該研究團(tuán)隊(duì)通過模擬骨的多級(jí)結(jié)構(gòu)及多細(xì)胞組成，采用光固化3D打印技術(shù)制備出仿哈弗斯骨結(jié)構(gòu)生物陶瓷支架，并負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管化骨的修復(fù)。該研究成果近日發(fā)表在Science子刊Science Advances雜志(Sci. Adv. 2020; 6 : eaaz6725)上，并申請(qǐng)專利一項(xiàng)。論文第一作者為上海硅酸鹽所在讀博士生張猛，指導(dǎo)教師為吳成鐵研究員。

支架的制造是成功進(jìn)行骨再生的核心，但這仍然是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中仍然很困難，盡管已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究項(xiàng)目，從使用納米管的變化到控制抗生素釋放、替代材料和涂層的結(jié)構(gòu)。

正如作者所指出的那樣，雖然生物打印是醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)領(lǐng)域，科學(xué)家已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步，但仍然有許多原因?qū)е抡系K：
•層次結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性
•機(jī)械性能要求
•骨駐留細(xì)胞的多樣性

然而，大多數(shù)再生發(fā)生在松質(zhì)骨中，因此，研究人員在成功治療患者時(shí)必須關(guān)注的重點(diǎn)：

松質(zhì)骨是由板狀或棒狀結(jié)構(gòu)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，厚度約為200毫米。據(jù)估計(jì)，80％的骨重塑過程發(fā)生在松質(zhì)骨中。但是，骨骼再生不僅需要重建骨骼結(jié)構(gòu)，還需要修復(fù)血管或神經(jīng)等其他組織。

仿生結(jié)構(gòu)正顯示出作為“高性能骨組織工程生物材料”的巨大潛力，這使得研究團(tuán)隊(duì)將重點(diǎn)放在使用3D打印哈弗斯生物陶瓷結(jié)構(gòu)上，該結(jié)構(gòu)可以以“簡單而通用的設(shè)計(jì)”模仿骨骼。

該團(tuán)隊(duì)將骨的哈弗斯管、福爾克曼管及松質(zhì)骨三部分結(jié)構(gòu)一體化打印，通過改變哈弗斯管數(shù)量、直徑以及福爾克曼管數(shù)量實(shí)現(xiàn)了對(duì)結(jié)構(gòu)的精細(xì)調(diào)控，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了對(duì)力學(xué)強(qiáng)度及孔隙率的調(diào)控，能夠滿足不同患者的個(gè)性化定制需求。該研究還模擬骨的多細(xì)胞組成，將具有成血管作用的內(nèi)皮細(xì)胞負(fù)載于哈弗斯管，將具有成骨作用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞負(fù)載于松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，并將兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了多細(xì)胞的負(fù)載與運(yùn)輸，顯著促進(jìn)了兩種細(xì)胞的增殖以及各自成骨、成血管基因的表達(dá)。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明負(fù)載兩種共培養(yǎng)細(xì)胞支架的體內(nèi)成骨、成血管效果顯著優(yōu)于單培養(yǎng)細(xì)胞支架及無細(xì)胞支架，體現(xiàn)了這種多細(xì)胞遞送系統(tǒng)的血管化骨修復(fù)能力。這種基于仿哈弗斯骨結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞遞送系統(tǒng)還可以遞送多種骨組織常駐細(xì)胞，由于哈弗斯管內(nèi)有血管和神經(jīng)并行穿過，該團(tuán)隊(duì)還將具有神經(jīng)修復(fù)作用的雪旺細(xì)胞負(fù)載于哈弗斯管內(nèi)，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞負(fù)載于松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)負(fù)載兩種共培養(yǎng)細(xì)胞支架的成神經(jīng)基因表達(dá)顯著優(yōu)于單培養(yǎng)細(xì)胞支架，體現(xiàn)了這種基于仿哈弗斯骨結(jié)構(gòu)支架的多細(xì)胞遞送系統(tǒng)的普適性特征，可模擬體內(nèi)多細(xì)胞組織工程的再生微環(huán)境。

具有皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的哈弗斯骨模擬生物陶瓷支架的3D打印。皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)包含哈弗斯管和福爾克曼管。（A到E）光學(xué)顯微鏡圖像顯示出不同的直徑（D）和由洋紅色箭頭（A）表示的哈弗斯管的數(shù)量（N）N = 8，D = 0.8 毫米；（B）N = 8，D = 1.2毫米；（C）N = 8，D = 1.6毫米；（D）N = 4，D = 1.6毫米; （E）N = 2，D = 1.6毫米。比例尺，1毫米。（A到E）微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）圖像顯示連接支架內(nèi)部的哈弗斯管的福爾克曼管（藍(lán)色箭頭）。比例尺，1毫米。（F至J）SEM圖像顯示了支架的微觀結(jié)構(gòu)。

研究人員表示：“相互連接的哈弗斯管是從松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)中分離出來的，用于非接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)。此外，將支架的外圍和底部密封起來，以便可以將支架用于固定接種的細(xì)胞�！�

創(chuàng)建支架需要幾種不同的技術(shù)，包括使用靜電紡絲和雙螺桿擠出，模塊化組織工程和3D打印。該團(tuán)隊(duì)在DLP 3D打印方面取得了最大的成功，設(shè)計(jì)了一系列具有哈弗斯管，福爾克曼管和松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)。

用于HBMSC-HUVEC共培養(yǎng)系統(tǒng)的仿生骨仿生生物陶瓷支架在細(xì)胞增殖和血管生成分化方面的表現(xiàn)比單培養(yǎng)更好。（A到D）接種在松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)上的HBMSC的CLSM圖像（A）和接種在哈弗斯管上的HUVEC直徑不同，（B）D = 1.6毫米，（C）D = 1.2毫米，（D）D = 0.8毫米。比例尺，100微米。（E到H）SEM圖像，（E）接種在松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)上的HBMSC和HUVEC接種在哈弗斯管上，直徑分別為（F）1.6毫米，（G）1.2毫米和（H）0.8毫米。（I和J）培養(yǎng)1、3、7、14天后，接種在具有不同（I）直徑和（J）哈弗斯支架上的HBMSC，HUVEC和共培養(yǎng)的HBMSC-HUVEC的增殖活性。n = 6個(gè)重復(fù)。（K和L）HBMSC，HUVEC，Co-HBMSC（HBMSC-HUVEC共培養(yǎng)中的HBMSC）和Co-HUVEC（HBMSC-HUVEC共培養(yǎng)中的HUVEC）的成骨（K）和血管生成（L）基因表達(dá)，持續(xù)3天。n = 3個(gè)重復(fù)。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，$ P <0.05，$$ P <0.01。

基于哈弗斯的模仿生物陶瓷支架的rBMSC-rSC共培養(yǎng)系統(tǒng)在細(xì)胞增殖和神經(jīng)原性分化方面比單培養(yǎng)表現(xiàn)更好。（A到D）（A）rBMSC單培養(yǎng)組和rBMSC-rSC共培養(yǎng)組中rBMSC的CLSM圖像，其中rBMSC與rSC的比率為（B）3：7，（C）5：5和（D） 7：3負(fù)載在支架的松質(zhì)骨上。比例尺，50微米。（E到H）（E）rSC單培養(yǎng)組和rBMSC-rSC共培養(yǎng)組中rSC的CLSM圖像，其中rBMSC與rSC的比率為（F）3：7，（G）5：5和（H） 7：3負(fù)載在哈弗斯管支架上。

“在這里，我們進(jìn)一步建立了基于哈弗斯仿骨支架的rBMSC-rSC共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中在松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)中生長的rBMSC和在哈弗斯管中生長的rSC。我們的結(jié)果表明，與rSC單培養(yǎng)相比，rBMSC-rSC共培養(yǎng)系統(tǒng)表現(xiàn)出更好的增殖和NGF，BDNF，TrkA和S100的更高表達(dá)。發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)SC增殖，傳統(tǒng)上被用于促進(jìn)感覺系統(tǒng)的恢復(fù)。”研究團(tuán)隊(duì)表示。

考慮到哈弗斯仿骨支架的臨床應(yīng)用，仍有一些問題需要研究。首先，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中應(yīng)進(jìn)一步考慮更多的骨駐留細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。多細(xì)胞協(xié)同作用的機(jī)制尚不完全清楚。需要進(jìn)一步的研究來確定共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)基于哈弗斯仿骨支架的共培養(yǎng)系統(tǒng)中新骨骼，血管和神經(jīng)形成的個(gè)體影響。