手術(shù)中生物打�。菏中g(shù)環(huán)境下的組織與器官修復(fù)

來源：EngineeringForLife  

術(shù)中直接3D生物打印技術(shù)（下文簡稱“術(shù)中打印”）可以通過快速獲取受損部位的信息，在活體上進(jìn)行生物打印修復(fù)受損組織器官，是一種高效的生物打印策略。對于需要進(jìn)行組織切除、創(chuàng)傷重建或骨折修復(fù)的患者，術(shù)中進(jìn)行受損部位的掃描和生物打印對于提高修復(fù)的準(zhǔn)確性和效率具有很大的潛力。近期，哈爾濱工業(yè)大學(xué)（深圳）的吳洋教授連同美國賓夕法尼亞州立大學(xué)的Ibrahim T. Ozbolat教授與DinoJ. Ravnic教授在Trends in Biotechnology雜志上發(fā)表了題為“Intraoperative Bioprinting: Repairing Tissues and Organs in a Surgical Setting”的觀點(diǎn)性綜述文章，從工程和臨床的角度為讀者介紹當(dāng)前術(shù)中打印的主要局限，以及未來其從實(shí)驗室到臨床轉(zhuǎn)化的潛力，并著重展開介紹血管化組織和復(fù)合組織的術(shù)中打印。

一、從體外生物打印到術(shù)中打印
在過去的十年中，生物打印技術(shù)取得了長足的進(jìn)步，并在不同組織工程領(lǐng)域得到應(yīng)用，如組織再生、血管形成、藥物篩選和疾病建模等。然而，大多數(shù)生物打印工作是在體外進(jìn)行，需要在體內(nèi)進(jìn)一步驗證。雖然器官直接打印入人體仍十分困難，但科研人員已做出了一些嘗試。 術(shù)中打印，也稱為原位打印或體內(nèi)生物打印，是指在手術(shù)中對活體進(jìn)行生物打印的技術(shù)，包括缺損部位成像、數(shù)據(jù)處理、工藝路徑規(guī)劃和生物打印等在整個手術(shù)過程中的有序進(jìn)行。組織替代物的術(shù)中打印得益于其可以在解剖學(xué)上準(zhǔn)確地重現(xiàn)復(fù)雜組織的異質(zhì)性。盡管術(shù)中打印尚未臨床化，但在生物打印技術(shù)的快速發(fā)展以及不同領(lǐng)域研究人員的共同努力下，該領(lǐng)域正在穩(wěn)步地發(fā)展。

術(shù)中打印有諸多優(yōu)勢。首先，基于水凝膠或細(xì)胞聚集體的組織替代物由于其富水特性，初始機(jī)械性能通常較弱，使得其在手術(shù)操作過程中容易被破壞甚至解體。相反，借助逆向工程方法實(shí)現(xiàn)植入體的實(shí)時設(shè)計，術(shù)中打印可以最大限度地降低缺損修復(fù)中的污染、結(jié)構(gòu)體崩解和手動干預(yù)帶來的風(fēng)險。更重要的是，術(shù)中打印可以應(yīng)對臨床上由于清創(chuàng)或組織切除而產(chǎn)生的具有不規(guī)則平面的組織缺損。相比之下，體外生物打印通常假設(shè)工作表面平整，與臨床情況不符。此外，由于術(shù)中打印修復(fù)的結(jié)構(gòu)被天然組織包裹，內(nèi)源性細(xì)胞通過生物化學(xué)與物理方式的誘導(dǎo)，可以遷移到打印的結(jié)構(gòu)中，并分化成具有靶組織特異性的譜系。另外，與手動注射生物材料進(jìn)入缺損部位相比，術(shù)中打印可以精確地沉積細(xì)胞、基因或細(xì)胞因子，實(shí)現(xiàn)局部結(jié)構(gòu)的精確控制與解剖學(xué)仿生。對于異質(zhì)細(xì)胞形成的組織及區(qū)域分層排列的細(xì)胞外基質(zhì)，術(shù)中打印具備精確重構(gòu)多層結(jié)構(gòu)的能力，這是使用手動方式難以實(shí)現(xiàn)的。最后，水凝膠的形狀變形（例如皮膚再生過程中膠原蛋白的收縮）也是生物打印結(jié)構(gòu)在體外成熟過程中面臨的問題。此外，細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中會重塑基質(zhì)，并最終改變甚至破壞預(yù)先設(shè)計的形態(tài)。因此，術(shù)中打印的優(yōu)勢也體現(xiàn)在體內(nèi)整合過程中再生組織可能占據(jù)由于打印結(jié)構(gòu)收縮產(chǎn)生的空隙，并調(diào)節(jié)基質(zhì)的重塑。

二、術(shù)中打印的最新進(jìn)展
盡管術(shù)中打印的概念在2007年就首次被提出，但由于在活體上進(jìn)行生物打印難以實(shí)現(xiàn)，后續(xù)較少有相關(guān)的研究報道。相對于植入預(yù)先制備的結(jié)構(gòu)體，術(shù)中打印對生物墨水的制備、生物打印設(shè)備、滅菌和手術(shù)操作提出了更高的要求。到目前為止，研究人員已運(yùn)用術(shù)中打印針對軟骨、骨骼和皮膚的修復(fù)進(jìn)行了一些嘗試。例如，手持式生物墨水?dāng)D出設(shè)備已被分別用于羊的軟骨修復(fù)模型（圖1A）和豬與鼠的皮膚修復(fù)模型。盡管材料沉積過程是手動進(jìn)行的，但手持設(shè)備提出了一套完善的策略以減少水凝膠交聯(lián)所需的外部設(shè)備。在骨骼修復(fù)方面，Keriquel課題組使用自主開發(fā)的激光生物打印系統(tǒng)在小鼠顱骨缺損模型中進(jìn)行術(shù)中打印（圖1B）。在他們的后續(xù)研究中，術(shù)中打印產(chǎn)生了組織化的微血管網(wǎng)絡(luò)和顱骨缺損的骨再生。目前，由于皮膚的易接觸性與強(qiáng)大的再生能力，術(shù)中打印最成功的案例大多與皮膚修復(fù)相關(guān)。近來，Albanna課題組開發(fā)了一款集成了生物成像技術(shù)的移動式皮膚生物打印系統(tǒng)，并對小鼠和豬的全層皮膚傷口模型進(jìn)行了修復(fù)（圖1C）。下文將重點(diǎn)介紹目前術(shù)中打印在工程和臨床方面的主要局限，并突出闡述其在血管化組織和復(fù)合組織重建中的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

圖1 各種術(shù)中打印技術(shù)在不同組織修復(fù)中的應(yīng)用

三、術(shù)中打印的關(guān)注點(diǎn)與未來展望
1. 當(dāng)前生物打印方式的局限性
生物打印按技術(shù)主要可分為擠出式、液滴式與激光式。將現(xiàn)有的技術(shù)直接應(yīng)用于術(shù)中打印會面臨諸多挑戰(zhàn)。擠出式的生物打印可被認(rèn)為最適用于術(shù)中打印。手動注射（擠出）生物材料已在臨床上應(yīng)用了數(shù)十年，擠出式打印頭可以被方便地配置在當(dāng)前應(yīng)用于泌尿外科和婦科的手術(shù)機(jī)器人上，實(shí)現(xiàn)術(shù)中打印。然而，由于擠出式打印頭多為接觸式，打印頭可能會干擾缺損部位周邊的正常組織。對于液滴式打印技術(shù)，盡管其分辨率優(yōu)于擠出式，但生物墨水在針頭小孔處的沉淀會提高噴嘴堵塞的風(fēng)險，增加手術(shù)時間并引發(fā)其他并發(fā)癥。受限于打印結(jié)構(gòu)較弱的機(jī)械性能，液滴式技術(shù)更適合打印厚度較薄的組織，例如皮膚。激光式打印技術(shù)具有與液滴式相似的優(yōu)勢（如：高分辨率）和劣勢 （如：打印結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度低）。由于其組成部件的復(fù)雜性（如：激光源和光學(xué)組件），激光式打印設(shè)備的小型化也是一項挑戰(zhàn)， 復(fù)雜的組件限制了體內(nèi)深層組織打印的可能性。

2. 生物墨水與手術(shù)環(huán)境的兼容性
由于術(shù)中打印的材料沉積是直接在生理條件下進(jìn)行的，因此，理想的生物墨水不僅應(yīng)滿足一般生物墨水要求，而且還應(yīng)具備一些特定屬性，包括1）與所用打印技術(shù)兼容并可進(jìn)行術(shù)中打印，以縮短手術(shù)時間，2）可快速地在生理溫度與濕度條件下進(jìn)行原位交聯(lián)，以保留打印結(jié)構(gòu)的完整性和分辨率，3）可商業(yè)化與平價化，以降低手術(shù)成本。因此，大多數(shù)常用的需要揮發(fā)性有機(jī)溶劑溶解或高溫熔融的生物材料（如：聚己內(nèi)酯，聚乳酸等）不適用于術(shù)中打印。在水凝膠中，盡管膠原蛋白在37°C可轉(zhuǎn)變?yōu)槟�膠狀態(tài)，但其緩慢的凝膠化阻礙了其在術(shù)中打印中的使用；然而，納米羥基磷灰石增強(qiáng)的膠原蛋白在骨組織的術(shù)中打印中表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。由于纖維蛋白原可與凝血酶輪流打印實(shí)現(xiàn)快速交聯(lián)，其在術(shù)中打印中也很受歡迎。光交聯(lián)生物油墨，例如明膠甲基丙烯酰胺（GelMA）、透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯（HAMA）和聚乙二醇也常用于生物打印。由于將生命體直接暴露在紫外線中可能損傷組織，一種可行方案是將紫外線射向透明打印頭的側(cè)面，在生物墨水?dāng)D出過程中實(shí)現(xiàn)交聯(lián)固化。近來，由于可見光光引發(fā)系統(tǒng)能避免使用紫外線交聯(lián)破壞細(xì)胞活性，其應(yīng)用也開始普及。除現(xiàn)有的生物墨水外，更多適用于術(shù)中打印的材料應(yīng)被開發(fā)來為術(shù)中打印提供更多選擇。新材料應(yīng)能在無支撐結(jié)構(gòu)的情況下保留生物打印結(jié)構(gòu)的完整性。

3. 術(shù)中打印過程的自動化
由于傷口的長時間暴露會增加手術(shù)并發(fā)癥的風(fēng)險，因此，缺損部位的成像應(yīng)在組織切除后的數(shù)分鐘內(nèi)完成。為了滿足此要求，基于3D攝影測量的掃描技術(shù)為獲取缺損部位的形貌數(shù)據(jù)技術(shù)提供了最優(yōu)解決方案。此類掃描儀能夠達(dá)到高達(dá)30 μm的分辨率，掃描時間短，且具有便攜性等優(yōu)勢。此外，圖像處理在創(chuàng)建組織模型時也必不可少，包括圖像預(yù)處理、分割、特征提取和數(shù)據(jù)挖掘等。術(shù)中打印式，上述所有過程應(yīng)在獲取掃描數(shù)據(jù)后的幾分鐘內(nèi)完成。因此，優(yōu)秀的圖像分割軟件對于方便地提取感興趣區(qū)域的3D圖像信息至關(guān)重要。由于不同的缺損組織具有其獨(dú)特的紋理特征，不當(dāng)?shù)膱D象后處理可能會生成無意義的3D模型，因此，需要對模型進(jìn)行仔細(xì)評估。人工智能和機(jī)器人技術(shù)可以協(xié)助減少圖象處理時間和操作員造成的誤差。迄今，研究人員一直致力于優(yōu)化術(shù)中打印的路徑規(guī)劃，例如使用運(yùn)動跟蹤在自由移動的手部解剖結(jié)構(gòu)上進(jìn)行打印。將來，機(jī)器學(xué)習(xí)也可用于自動產(chǎn)生最佳的生物打印策略。

由于水凝膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化和手術(shù)中活體運(yùn)動（如：呼吸）引起的形狀變形， 實(shí)現(xiàn)術(shù)中打印的自動化、保證打印精度具有很大的挑戰(zhàn)性。此難題有望通過實(shí)時監(jiān)控技術(shù)觀察打印結(jié)構(gòu)的形變，為后續(xù)材料沉積提供反饋信號來解決。當(dāng)前已商品化的三軸生物打印設(shè)備不足以應(yīng)對具有不規(guī)則形狀的缺損組織的術(shù)中打印，需要使用具有更高自由度的平臺，多自由度的機(jī)械臂（如：手術(shù)機(jī)器人）可能是理想的解決方案（圖2A）。

4. 術(shù)中打印組織的血管化
血管化對于生物打印結(jié)構(gòu)的成熟至關(guān)重要，尤其是節(jié)段性缺損。驅(qū)使術(shù)中打印組織的微血管化有多種方式，例如生物打印內(nèi)皮祖細(xì)胞、缺氧誘導(dǎo)因子或血管內(nèi)皮生長因子等。由于新血管生成通常需要10天以上才能開始發(fā)生，一些暫時性策略可以用來延長氧氣供應(yīng)。 例如，在生物墨水中參入富氧微粒或制氧生物材料，此類生物墨水旨在為細(xì)胞提供營養(yǎng)直到毛細(xì)血管可以傳輸血液。多孔內(nèi)部結(jié)構(gòu)的引入是生物打印的優(yōu)勢，同時也為促進(jìn)血液從宿主組織滲透到打印結(jié)構(gòu)體提供了另一種選擇。

術(shù)中打印的最終目標(biāo)是創(chuàng)建一個連接動脈和靜脈、包含嵌入式微脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)體。隨著超顯微外科技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在直接吻合內(nèi)徑小于150μm的微血管已經(jīng)變得可行。該技術(shù)進(jìn)步使得植入體無需暴露于主血管樹便可快速實(shí)現(xiàn)血液流動。為了促進(jìn)植入體的吻合和血管形成，手術(shù)中也可以利用各種自體導(dǎo)管創(chuàng)建動靜脈循環(huán)。

圖2 術(shù)中打印修復(fù)血管化復(fù)合組織的示意圖

5. 復(fù)合組織的術(shù)中打印及其臨床轉(zhuǎn)化
當(dāng)前，具有多個組成部分的組織的無縫重建仍存在局限，例如：顱頜面缺損（皮膚，骨骼和肌肉），骨軟骨缺損（軟骨和骨骼）以及肌肉骨骼缺損（骨骼，肌肉，肌腱和皮膚）。不同組織類型在生理學(xué)、解剖學(xué)和組織學(xué)方面存在差異，因此，不同組織層的精確打印至關(guān)重要。由于將不同部位的干細(xì)胞分化為多個譜系能夠模仿天然組織的解剖結(jié)構(gòu)，術(shù)中打印需要精確而高效地沉積干細(xì)胞和分化因子。以肌骨骼為例，它由內(nèi)而外包括骨骼、血管、肌肉、皮下脂肪和皮膚組織，包含10種以上細(xì)胞類型 （圖2B）。

復(fù)合組織的術(shù)中打印應(yīng)以最少的手動干預(yù)快速獲取缺損部位信息 ，保證解剖學(xué)上的準(zhǔn)確性。雖然結(jié)構(gòu)體打印時通常按照天然組織的層次結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計，然而，打印組織在成熟過程中可能會改變其結(jié)構(gòu)和表型，從而與天然組織產(chǎn)生差異。由于復(fù)合組織通常厚度較大，因此血管形成對于促進(jìn)組織再生特別重要；血管化不足將導(dǎo)致壞死的疤痕組織占據(jù)缺損部位。目前，皮瓣外科手術(shù)是修復(fù)復(fù)合節(jié)段性缺損的標(biāo)準(zhǔn)。皮瓣是一種自體組織移植物，其中供體組織連同其血管蒂（動脈和靜脈）被整體轉(zhuǎn)移到受體部位。這種技術(shù)徹底改變了大型創(chuàng)傷和腫瘤缺陷的治療方法。但是，皮瓣有限的供體數(shù)量和供體部位發(fā)病率限制了其應(yīng)用。因此，最好的方案是將該手術(shù)原理和術(shù)中打印技術(shù)相結(jié)合。外科醫(yī)生可以通過直接血管吻合或誘導(dǎo)血管生成的方式將受體血液灌注至鄰近的打印結(jié)構(gòu)體中。兩者的結(jié)合將會消除關(guān)于供體數(shù)量和發(fā)病率的擔(dān)憂，同時提供精確匹配的替換組織。未來，生物打印的組織工程化植入物或可代替自體皮瓣。

術(shù)中打印的另一個關(guān)注點(diǎn)是天然組織與打印組織，特別是無血管組織的融合（如：軟骨修復(fù)）。由于骨骼先天具有較強(qiáng)的修復(fù)能力，軟骨在垂直方向上可以與下層骨整合。術(shù)中打印具有骨軟骨界面的復(fù)合組織也是提高軟骨愈合能力的一個有效的解決方案，可以被應(yīng)用到全厚度骨軟骨的缺損修復(fù)中。然而，打印軟骨與天然軟骨的橫向連接將是實(shí)現(xiàn)永久性軟骨置換的主要障礙。增強(qiáng)軟骨橫向整合的策略包括生物墨水的功能化，使之能直接粘合到到相鄰的天然軟骨上。
此外，目前術(shù)中打印用到的動物模型很少是承重型組織，例如皮膚和顱骨缺損。未來，將術(shù)中打印用于修復(fù)承重型缺損模型，如長骨的節(jié)段性缺損和關(guān)節(jié)缺損，將獲得更多關(guān)注。術(shù)中打印結(jié)構(gòu)體的機(jī)械強(qiáng)度取決于生物墨水的固有特性，可以通過開發(fā)新材料來提高結(jié)構(gòu)體的機(jī)械強(qiáng)度。在這方面，可設(shè)想將柔性生物墨水與熱塑性生物材料（如：聚己內(nèi)酯或聚乳酸-乙醇酸共聚物）相結(jié)合，開發(fā)一種便于熱塑性材料快速、安全冷卻的打印技術(shù)（如：基于激光的冷卻系統(tǒng)）。另外，常規(guī)的術(shù)后護(hù)理和康復(fù)仍然必不可少，直到打印的組織獲得足夠的機(jī)械強(qiáng)度。

四、結(jié)語
術(shù)中打印已在組織再生的應(yīng)用中，包括軟骨，皮膚和骨骼等，顯示了其潛力。然而，復(fù)合組織包含軟、硬組織以及之間的界面組織，其再生修復(fù)有賴于具有快速穩(wěn)定的交聯(lián)性能的生物墨水以及先進(jìn)生物打印技術(shù)的開發(fā)。此外，尋求一種切實(shí)可行的方法來促進(jìn)血管生成對于組織長期的功能化至關(guān)重要。將生物打印與血管吻合術(shù)相結(jié)合，代替目前流行的皮瓣手術(shù)，顯得十分具有吸引力。從長遠(yuǎn)來看，術(shù)中打印的自動化不僅是打印流程的簡單集成，同時也需要大量臨床案例來優(yōu)化生物打印的策略。除了科學(xué)方面的考量，術(shù)中打印的臨床研究也將面臨倫理與監(jiān)管的考驗，共享病人信息用于數(shù)據(jù)庫的建立將引發(fā)私人信息與知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)方面的挑戰(zhàn)。盡管面臨諸多問題，作者仍堅信術(shù)中打印將在組織器官修復(fù)再生領(lǐng)域產(chǎn)生巨大作用。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2020.01.004