3D打印纖連蛋白材料支架

來(lái)源：EngineeringForLife

纖連蛋白（Fn）是正常組織中含量最多的ECM蛋白。Fn表達(dá)的上升與多種癌癥有關(guān)。例如在乳腺癌惡化的過(guò)程中，纖維纖連蛋白（fFn）會(huì)促進(jìn)腫瘤的生成和遷移，一方面是因?yàn)閻盒约?xì)胞中發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。除此以外，F(xiàn)n含量上調(diào)被認(rèn)定為是癌癥轉(zhuǎn)移壁龕形成前的重要一步。Fn作為一種機(jī)械敏感性蛋白，當(dāng)溶解在血漿中時(shí)總以比較緊湊聚集的狀態(tài)存在，而當(dāng)存在于ECM中時(shí)（例如fFn）則處于各種各樣的拉伸狀態(tài)。Fn的結(jié)構(gòu)則決定了影響其生物功能和細(xì)胞響應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)是裸露還是隱蔽。Fn的原纖維生成需要通過(guò)力學(xué)遷移綁定在細(xì)胞表面受體上的整合素，來(lái)解構(gòu)蛋白。而從結(jié)構(gòu)角度來(lái)說(shuō)，這一解構(gòu)過(guò)程大部分發(fā)生在I型位點(diǎn)（Fn-3），這一區(qū)域會(huì)暴露自締合位點(diǎn)來(lái)促成隨后的原纖維生成。然而多年以來(lái)，人們依舊無(wú)法完全弄清Fn的I,II,III型位點(diǎn)是如何相互以及與細(xì)胞作用，從而形成原纖維的。除此以外，如何生成穩(wěn)定有效的fFn纖維網(wǎng)絡(luò)也是一個(gè)難點(diǎn)。雖然之前有很多研究實(shí)現(xiàn)了無(wú)細(xì)胞的生成Fn網(wǎng)絡(luò)，但是這些方法通常在應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)和分析時(shí)，往往缺乏以下四個(gè)特點(diǎn)：i)有效的細(xì)胞滲入和去除能力ii)足夠透明易于觀察iii)為細(xì)胞沉積基質(zhì)或者黏附提供一個(gè)支撐iv)足夠大面積的沒(méi)有合成材料的3D空間。

纖連蛋白（Fn）作為一種尤為重要的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，常常在2維或者3維的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，被用為涂層來(lái)創(chuàng)造一個(gè)能夠支持細(xì)胞存活的環(huán)境。但是，這些蛋白涂層的涂覆方式都和體內(nèi)細(xì)胞沉積出來(lái)的用來(lái)組成ECM的Fn網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能不一致。近期，來(lái)自密西根大學(xué)的Joerg Lahann教授團(tuán)隊(duì)在Advanced Materials雜志上發(fā)表了題為Engineered Fibrillar Fibronectin Networks as Three-Dimensional Tissue Scaffolds的文章，報(bào)道了一種用網(wǎng)格狀聚合物支架支撐，無(wú)細(xì)胞，力學(xué)性能好，且尺度可控的3維纖維纖連蛋白（fFn）網(wǎng)絡(luò)。作者通過(guò)在空氣，F(xiàn)n溶液和網(wǎng)格支架的3相交界處，通過(guò)水動(dòng)力誘導(dǎo)的方式，可以形成十分穩(wěn)定的fFn網(wǎng)絡(luò)。該fFn網(wǎng)絡(luò)可以促進(jìn)細(xì)胞的滲透和增殖，并可體外擴(kuò)增原代癌細(xì)胞，誘導(dǎo)其間質(zhì)轉(zhuǎn)化。未來(lái)，該人造fFn網(wǎng)絡(luò)有望應(yīng)用于基礎(chǔ)細(xì)胞研究，精準(zhǔn)醫(yī)療，藥物測(cè)試和臨床前診斷。

圖1. 水動(dòng)力誘導(dǎo)Fn原纖維生成

作者利用支架輕微剪切Fn溶液（角速度8轉(zhuǎn)/分鐘），在空氣，F(xiàn)n溶液和支架三相接觸部位產(chǎn)生非溶液狀態(tài)的fFn網(wǎng)絡(luò)，整個(gè)過(guò)程沒(méi)有使用變性劑（圖1）。支架利用3D jet writing[2]方法打印PLGA獲得，帶有500x500um方形孔，厚度120um，可為細(xì)胞的滲透和生長(zhǎng)提供更大體積的懸浮蛋白基質(zhì)。所制造出的fFn網(wǎng)絡(luò)與人類纖維母細(xì)胞沉積的基質(zhì)的形態(tài)類似。

圖2. fFn網(wǎng)絡(luò)在老鼠乳腺癌模型中提升腫瘤移植效率

由于Fn為原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，作者測(cè)試了fFn網(wǎng)絡(luò)在老鼠乳腺癌模型中提升腫瘤移植效率的能力（圖2）。首先，作者在支架上培養(yǎng)了AT-3小鼠乳腺癌細(xì)胞，這種細(xì)胞會(huì)在fFn網(wǎng)絡(luò)上穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶。隨后，帶著30000細(xì)胞的fFn支架被植入免疫活性C57BL/6老鼠。生物放光成像圖片顯示，在支架中，初始的腫瘤生成信號(hào)在植入后兩天便出現(xiàn)。相反，在細(xì)胞懸液中經(jīng)過(guò)21天也未曾出現(xiàn)腫瘤移植。移植腫瘤的組織學(xué)圖片顯示，癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)fFn網(wǎng)絡(luò)侵入了周圍組織。增長(zhǎng)的致瘤性與體外測(cè)試結(jié)果一致，fFn網(wǎng)絡(luò)中的AT-3細(xì)胞增加了腫瘤初始亞群（CD29+/CD24+）和轉(zhuǎn)移（CD29+/CD24+/CD90.2+）。

圖3. fFn網(wǎng)絡(luò)增加MDA-MB-468人類乳腺癌細(xì)胞的腫瘤初始細(xì)胞量

隨后，作者又測(cè)試了fFn網(wǎng)絡(luò)在人類三陰性乳腺癌細(xì)胞中是否也會(huì)增加致瘤性。選用了MDA-MB-468細(xì)胞系列（圖3）。四天的擴(kuò)增之后，MDA-MB-468細(xì)胞形成了擴(kuò)展面積達(dá)到10平方毫米的致密3D癌癥微環(huán)境。與培養(yǎng)在組織培養(yǎng)聚苯乙烯（TCPS）上，和Fn涂覆的TCPS上的細(xì)胞相比，fFn網(wǎng)絡(luò)上的CD44+/CD24−亞群顯著高于前兩者。除此以外，在所有時(shí)間點(diǎn)上，fFn網(wǎng)絡(luò)上的CD44+/CD24−/ALDH+亞群也是顯著高于控制組的。MDA-MB-468細(xì)胞培養(yǎng)4天之后，fFn網(wǎng)絡(luò)被去細(xì)胞化并且針對(duì)Fn和層連蛋白共染色。結(jié)果證明MDA-MB-468細(xì)胞只是分泌了少量的層連蛋白，而原本的fFn網(wǎng)絡(luò)還是保存完好。證明Fn是早期上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要ECM因素。

圖4. fFn網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)增病人乳腺癌細(xì)胞

最后，作者測(cè)試了利用fFn網(wǎng)絡(luò)直接擴(kuò)增病人乳腺癌細(xì)胞的能力，結(jié)果顯示8天的時(shí)候，fFn支架的擴(kuò)增數(shù)量比對(duì)照組高出7倍，且fFn支架可以在體外誘導(dǎo)乳腺癌病人細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖5. 3D jet writing

文章中的網(wǎng)格狀聚合物支架由Joerg Lahann教授團(tuán)隊(duì)之前提出的3D Jet Writing工藝制造，相關(guān)文章于2018年發(fā)表在Advanced Materials雜志上，題為3D jet writing: functional microtissues based ontessellated scaffold architectures。該工藝的優(yōu)勢(shì)在于可以3維高精度地沉積聚合物纖維，且不需要像溶體電紡那樣高溫加熱，為載細(xì)胞的高精度電紡打印打下基礎(chǔ)。其特點(diǎn)在于在打印噴頭的底部安裝了一個(gè)副電極，抑制了纖維在沉積過(guò)程中的不穩(wěn)定，從而可以實(shí)現(xiàn)高重復(fù)精度的打印。

參考文獻(xiàn)：
[1] Jordahl S, Solorio L, Neale D B, et al. Engineered Fibrillar Fibronectin Networks as Three‐Dimensional Tissue Scaffolds[J]. Advanced Materials, 2019, 31(46): 1904580.
[2] Jordahl J H, Solorio L, Sun H, et al. 3D jet writing: functional microtissues based on tessellated scaffold architectures[J]. Advanced Materials, 2018, 30(14): 1707196.