南京大學鼓樓醫(yī)院關節(jié)外科史東泉：控制Kartogenin透明質酸凝膠修復關節(jié)軟骨的研究

丁建東：非常感謝徐教授！徐教授的每次報告，總是既哲理又詩情畫意。后面一個，本來是蔣青教授，現(xiàn)在由史東泉教授來作。蔣教授是鼓樓醫(yī)院關節(jié)外科的主任，史教授是副主任。史教授國家優(yōu)秀青年基金獲得者，我相信他在一線也工作若干年，肯定會有自己的見地，下面歡迎史教授給我們作報告！

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院關節(jié)外科副主任 史東泉的《控制Kartogenin透明質酸凝膠修復關節(jié)軟骨的研究》

    史東泉：尊敬的戴院士，謝謝主持人丁老師！
    我們也瞎做了一些東西，但是未來也許可能不是白做的，我覺得我們也在談一些轉化的事。
    作為一個關節(jié)外科大夫，大家知道我們整天就知道換關節(jié)。其實我們平時也想砸砸自己的飯碗，所以我們也想把軟骨修復修復。所以我們進行了軟骨修復做了一些工作，跟大家匯報一下。
    從臨床上來講，軟骨實際上真的非常糟糕。我們做過大量的流調，就是在一個小區(qū)里面60歲里面，問問他有沒有膝關節(jié)不舒服，60%以上的人都有這樣的體驗，覺得我確實很久沒有蹲下去了。這樣的問題，最終主要的問題出現(xiàn)在軟骨上來。很明顯的，這是我們在置換膝關節(jié)，但是白色軟骨四周都磨沒了，我們可以看到他的軟骨下骨。但是我們想想國內有將近八千萬的患者，需要去塑造這樣的軟骨。
    目前來講，其實從臨床上來講，我們有很多的方法。我們可以看一下，我們想做軟骨再生的時候，我們發(fā)現(xiàn)這樣的病人有大量的有局灶性軟骨缺損，當然還有一些年輕人的彌漫性的軟骨缺損�，F(xiàn)在有很多問題，包括種子細胞、一體化、軟骨表型的問題，始終沒有一個功能性的軟骨。上午很多老師講了他們的研究，其實作為臨床大夫來講，我們是希望策略越簡單越好，而不是說越復雜越好，因為越復雜就越難開展。
    我們每天早上7點點8點鐘都有討論，這樣的小分子有機化合物就是他們討論的東西。我們在2012年發(fā)現(xiàn)，這個小分子對骨髓間充質干細胞有明顯的向軟骨方向分化的作用。對于我們做軟骨的人來講特別敏感，一聽到有這樣的軟骨有什么樣的作用，我們會再繼續(xù)探索。在2014年的時候，發(fā)現(xiàn)有人把小分子分開，發(fā)現(xiàn)對滑膜關節(jié)的軟骨發(fā)育有很好的促進作用。我們再進一步探究它的機制，發(fā)現(xiàn)這樣的小分子有機物跟我們軟骨相關的分子有強烈的相關性。在這里，我們就在想能不能建立緩釋組織工程支架體系，從而獲得與天然軟骨相接近的材料？
    對于這樣的課題，大家一起坐下來談，想要解決哪些問題？第一個，我們作為古柯關節(jié)大夫來講，我們發(fā)現(xiàn)膝關節(jié)里面更多是滑膜，滑膜里面用大量的間充質干細胞。既然告訴我們這樣的小分子有機物對骨髓間充質干細胞有成軟骨作用。那整個課題告訴，滑膜類型的間充質干細胞作為成軟骨種子細胞，以骨髓間充質干細胞更有優(yōu)勢。而且很多臨床上的疾病，當時生出來這樣的組織，跟軟骨有很相似的外形形狀。如果它對滑膜間充質干細胞有成軟骨作用，我們就去探索到底什么樣的濃度是最佳的。如果我們找到這樣的濃度，那我們是不是拿到往關節(jié)內去打。如果關節(jié)內打打，我們發(fā)現(xiàn)能不能在臨床上盡量去運用它？這一系列的關鍵問題，就造成了這樣的課題，我們希望通過我們的研究，把這樣的幾個關鍵問題解決掉。
    于是我們開始了研究內容的設計。我們希望把滑膜和間充質干細胞分離出來，我們希望它也有軟骨作用，進一步想往天然軟骨方向轉化。
    那么我們就開始了我們第一步，我們把膝關節(jié)的滑膜取下來，取下來以后進行培養(yǎng)。我們發(fā)現(xiàn)到8個月以后，我們特別興奮地發(fā)現(xiàn)得到了這樣一個組織，我們只是做了一個離心的培養(yǎng)。當時，我們看到這樣的組織以后挺興奮的，因為跟我們手上看見的軟骨已經漸漸相似了。我們做了KGN，我們發(fā)現(xiàn)這樣一個類軟骨的組織，我們發(fā)現(xiàn)在這個軟骨里面有大量類軟骨的細胞，有組織的形成。我們當時就在想，這樣一個類軟骨組織到底是纖維軟骨還是透明軟骨？因為天然關節(jié)內是透明軟骨。當然如果我們經常不去手術，慢慢它轉成纖維軟骨。
    做軟骨都知道II型膠原是天然軟骨的關鍵，所以我們就去做了這樣一個熒光，我們發(fā)現(xiàn)這樣一個類軟骨組織里面，有大朗的II型膠原的表達。再比如我們的類天然的組織，很有可能跟天然透明軟骨相近。于是我們又做了現(xiàn)到4個禮，發(fā)現(xiàn)加入這個小分子有機物這個組里面的II型號膠原表達特別強烈。我們又檢測纖維軟骨透明性的表達，的時候，跟對照圖比有明顯的縮小，但是沒有讓我們特別開心、驚喜非常自信地的結果。這個小分子有機物是對于膝關節(jié)里面滑膜間充質干細胞有軟骨方向的分化。
    到這一步以后，我們就想既然它有這樣的作用，那就往關節(jié)內打打。于是我們就設計了第二部分，就是把這個小分子有機物往關節(jié)內打打，因此我們把在膝關節(jié)挖了一個洞，每個禮拜打一次，連續(xù)打三個月。到4個禮拜和12個禮拜的時候，我們去看這個兔子的組織。我們發(fā)現(xiàn)到4個禮拜的時候，雖然說跟對照圖比有明顯的縮小，但是沒有看到讓我們特別開心、驚喜的結果。但是到12個禮拜的時候，我們發(fā)現(xiàn)關節(jié)內打小分子有機物的注射組，明顯跟對照組比，有很好的治療作用，填充非常完整，邊緣相連。我們知道其實作為軟骨修復來講，它不止是軟骨和軟骨下骨的一個緊密連接，包括軟骨和周圍軟骨的緊密連接，是一個三維一體化的過程。所以緊接著我們用了甲苯胺藍色，我們發(fā)現(xiàn)4個禮拜的時候，跟對照比好像小了一點點，但是到12周的時候，發(fā)現(xiàn)我們在關節(jié)內打的這樣一個控制它軟骨修復最糟糕的一組，都比我們對照組要好很多。我們用番紅O染色去驗證我們這樣的結果，同樣地發(fā)現(xiàn)，我們治療組的最差的都比對照組最好的都要好很多。于是，我們又去做了II型膠原免疫組化，我們發(fā)現(xiàn)這樣的一個組織跟對照組比，顯然是有更多的II型膠原的表達。同時我們也檢測了I型膠原，發(fā)現(xiàn)修復組織I型膠原的表達是很弱的。所以從這一步來講，就是可以得出這樣的結論，就是關節(jié)腔里打這樣的小分子有機物，是可以治療軟骨缺損，我們也發(fā)表在arthritis research  therapy這樣的的雜志上。
    其實這個過程還有很多的問題，想要去做臨床轉化的，因為我們都知道反復地這樣的注射，對我們外科大夫來講是非常擔心的，因為不停地注射三個月的話，非常容易感染。而且我們關節(jié)內，到底到我真正缺損的地方有多少有效的治療濃度？這也是有困惑的。同時，如果對南京的病人來講，他一個禮拜來打一次，打三個月，可能他還可以接受。如果是哈爾濱或者是北京的話，讓他每周來打一次，顯然在臨床上是不可能推開的。
    于是我當時考慮想在缺損的地方，表面能夠有一個噴霧的東西，噴到關節(jié)的表面，就變成一層固定的膜。但是我當時沒有參加過這樣的會，如果有這么多老師知道我就好了。我跑到南大的高分子系，跑到很多搞高分子的地方。如果有一個東西，像噴霧噴到缺損的地方，變成堅硬的膜，來兜住我自己的藥物的話，這是非常困難的。因為只有這樣的一個操作過程，才能可能在臨床上操作，我可以噴點霧噴到缺損的地方，然后形成固體，或者在體溫作用下變成固體，能夠兜住局部的藥物，這才是可能轉化的。
    經過一年多的尋找，我才尋找到這樣的材料。我跟我高中同學聊天，聊聊我在做什么、我在做什么，把我的困惑告訴他。非常幸運的是他正好做高分子，然后他說我?guī)湍闳ハ胂脒@個東西能不能去解決，但是不一定是這種膜。于是他就回去，我們也不停地在溝通交流。于是回去以后他做了一個月告訴我，他說我想了，可不可以用在臨床上？他說我把你這個藥物包裹在液體里面，然后打到你缺損的地方，我給你固化，這樣局部的液體就不會跑，而且能給你有效釋放，到底釋放能多少？可能還需要我們一起討論。于是他進行了另一個實驗，他發(fā)現(xiàn)HA照射了以后又變成了固體。
    同時，我就四處找可以發(fā)紫外光的機器。后來好不容易在蘇州發(fā)現(xiàn)有這樣的發(fā)光器，因為只有這樣的發(fā)光器，才有可能在臨床上，我在膝關節(jié)打一個洞，高溫消毒以后，可以在關節(jié)內使用。
    現(xiàn)在匯報的時候，可以把幾秒鐘的東西過一下，其實我們光這個紫外光發(fā)光的條件就用了三個月，就是到底在缺損的地方距離多遠、發(fā)光的強度多少、時間有多長，其實這是反復過程當中。一開始做的時候，一發(fā)光就把軟骨燒紅了。所以在不斷摸索的過程中，才找到了相對比較可靠的照射過程。
    同時，他又幫我把它這個小分子有機物用納米包裹，他發(fā)現(xiàn)在體外顯示方兩個月，基本上在這樣的包裹下問題不大。如果前面兩部分的實驗是非常可靠的話，其實到了第三部分，這樣的試驗結果是我們很有信心，一定會比前面兩次更好。所以我們到12周三個月的時候，發(fā)現(xiàn)這樣的軟骨和天然軟骨幾乎沒有任何的差別。
    同時，我們做了各種染色，包括甲苯胺，包括番紅染色的評分，都跟天然的沒有太大的區(qū)別。到了4個禮拜的時候，我們從番紅染色看，還有幾個支架還在，還沒有完全吸收。但是跟4個禮拜的對照圖比，有明顯的很好的修復作用。到12周的時候，我們特別開心，因為我們發(fā)現(xiàn)這樣的修復組織周圍的液體基本上沒有了，這樣的修復過程發(fā)現(xiàn)，跟周圍正常軟骨比，發(fā)現(xiàn)跟它之間沒有任何的變化。
    我們用番紅進行染色，更讓我們興奮的是我們發(fā)現(xiàn)這樣的軟骨跟這樣的軟骨下骨的完全已經緊密結合在一起，沒有用分體的支架粘在一起，完全是靠同一個支架在不同環(huán)境作用下進行自己的軟骨生長。我們現(xiàn)在也投入很大的課題組，專門想看為什么這樣一個交界的地方，在周圍骨環(huán)境的情況下，跟周圍關節(jié)內軟骨不同微環(huán)境下，為什么骨、軟骨能夠一體化長得這么好。
    我們進行了II型膠原修復表達，我們發(fā)現(xiàn)這樣的修復組織的II型膠原表達甚至比周圍軟骨的II型膠原軟骨的表達更要好，說明我們這樣一個修復組織是非常接近于類天然軟骨。我們又去做I型膠原，就是說我們這樣的修復組織，基本上不會是這樣的纖維軟骨的成分。
    我們隨機取了一些修復的軟骨條和正常的軟骨條，我們送到北醫(yī)三院敖英芳進行檢測生物醫(yī)學，無論是硬度方面，跟正常軟骨相比都沒有太大的區(qū)別，說明我們這樣的修復軟骨是非常接近天然透明軟骨。
    其實對于我們臨床大夫來講，想要在臨床上能夠推廣或者非常好地利用，現(xiàn)在也是大家關心的。因為我們這樣的技術，跟原來的軟骨細胞技術相比，大家都知道原來的軟骨細胞要取正常的非修復性的軟骨進行體外培養(yǎng)再植入體內。這樣的兩步法，造成了這樣的軟骨細胞移植手術并不得到臨床大夫的非常認可，第一當然是因為它的費用非常貴，就算它搞活動，打折下來也要5萬塊錢。我們這樣成本，只要2萬多塊錢能解決，從成本上得到很好的降低。同時，我們不需要開放手術，只需要在關節(jié)下操作，我們在打支架的時候，可以把關節(jié)內液體全部吸掉，暴露缺損的地方，我們可以把這樣的支架注入到這樣的地方。更重要的是，其實軟骨并不是大家想象中的規(guī)則的圓柱形、立方體的，所有的骨軟骨移植手術都需要破壞正常的軟骨。而我們這樣的情況下，無論你損傷的軟骨是什么樣的形狀，我們不關心，我們用這樣的液體支架植入你原來損傷的組織，而且我們根本不需要取任何軟骨細胞，也不需要體外的干細胞，完全利用體內的滑膜間充質干細胞，還有骨髓間充質干細胞進行這樣的工作。
    這樣的國家發(fā)明專利，我們現(xiàn)在在談怎么樣在林場上進一步推廣。我想用一個簡單的動畫給大家介紹一下我們這樣的技術，其實這樣的缺損是不規(guī)則的，我們把它打進去以后變成固體的支架，同時在局部釋放我們的藥物，周圍各種種子細胞的歸巢，最后修復。謝謝！