上海大學蘇佳燦：3D打印GelMA/ AlgMA/羥基磷灰石支架用于構建功能性骨類器官

來源： EFL生物3D打印與生物制造

應對大骨缺損仍然是一個重大挑戰(zhàn)，因為自愈能力的固有限制導致了長時間的康復和亞優(yōu)化再生。雖然目前有臨床解決方案可用，但它們存在明顯的缺點，需要更有效的骨再生方法。源自干細胞的器官樣結構在這個領域顯示出巨大潛力；然而，骨器官樣結構的發(fā)展受到特定需求的限制，包括需要由支架和混合細胞外基質（ECM）提供堅固的機械支持。在這種背景下，生物打印技術已經(jīng)成為復制骨組織復雜結構的強大手段。

來自上海大學的蘇佳燦等團隊與來自上海第六人民醫(yī)院的施忠民團隊合作開發(fā)了一種利用新型生物墨水（GelMA/AlgMA/羥基磷灰石）制造高度復雜的骨細胞外基質模擬物的方法。生物打印支架有助于長期培養(yǎng)和逐漸成熟的大規(guī)模生物打印骨器官樣結構，促進多細胞分化，并為骨形成的初始階段提供有價值的見解。本研究的生物墨水的內(nèi)在自礦化特性與天然骨的性質非常接近，為器官樣結構賦予了增強的骨修復能力，適用于體外和體內(nèi)應用。這項開創(chuàng)性的研究推動了骨組織工程領域的發(fā)展，并在將其轉化為實際應用方面具有重大的潛力。相關工作以題為“Engineering Large-Scale Self-Mineralizing Bone Organoids with Bone Matrix-Inspired Hydroxyapatite Hybrid Bioinks”的文章發(fā)表在2024年04月20日的國際頂級期刊《Advanced Materials》。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容
本研究開發(fā)了一種生物墨水配方來模擬骨的復雜細胞外基質（ECM）的方法，該配方將羥基磷灰石與Gelatin Methacrylate和Alginate Methacrylate（GelMA/AlgMA）等有機聚合物結合在一起。所得的生物墨水具有獨特的自我礦化和細胞分化能力。當用于生物打印骨器官樣結構支架時，這些構建物在體外和體內(nèi)都顯示出功能性的機械支持、長期細胞培養(yǎng)和自我礦化能力。值得注意的是，在體內(nèi)培養(yǎng)時，生物打印的器官樣結構演變?yōu)轭愃扑笮喂堑慕Y構，表明骨器官樣結構的高度成熟性和其與天然海綿骨的機械相似性。值得注意的是，GelMA和GelMA/AlgMA等有機生物墨水無法形成骨器官樣結構。這項開創(chuàng)性的研究標志著首次成功制備了用于生物打印骨器官樣結構支架的混合生物墨水，并強調了無機成分在骨器官樣結構發(fā)展中的重要性，為進一步研究骨發(fā)育初期的分化和基質形成鋪平了道路。受合成骨基質啟發(fā)的具有自我礦化性能的生物墨水使得工程化的骨器官樣結構能夠密切模擬天然骨組織的結構、功能和再生潛力。這一進展的影響擴展到骨組織工程的各種應用，包括疾病建模、藥物篩選、個性化醫(yī)學和再生醫(yī)學。

【生物墨水和印刷支架的表征】
這些生物墨水表現(xiàn)出良好的可打印性，能夠產(chǎn)生精細的模型，包括兔子模型，具有高精度的打印，即使在幾毫米大小的尺寸上也能保持如此。為評估多孔打印能力，本研究打印了多孔支架。從頂視圖的分析中可以看出，即使在孔徑為50微米的情況下，所有孔隙都能夠一致地打印出來。本研究選擇了一個具有優(yōu)勢多孔結構的代表性圓柱支架用于后續(xù)的生物實驗，因為這種結構有利于營養(yǎng)物質的傳遞和細胞生長（圖1A）。掃描電子顯微鏡圖像證實，打印的支架具有精確的多孔結構，適合于胞載體應用。此外，GelMA/AlgMA/HAP打印的支架表面發(fā)現(xiàn)了Ca/P元素（圖1C），而GelMA和GelMA/AlgMA支架沒有出現(xiàn)Ca/P元素。為減輕凍干后水凝膠的形態(tài)改變，本研究進行了冷凍掃描電子顯微鏡觀察。GelMA/AlgMA/HAP水凝膠展示了更均勻的微孔結構。這對于成骨細胞礦化和構建納米到微米級別的骨梁是有利的（圖1B）。通過分析應力-應變曲線在彈性區(qū)域的斜率，特別是初始線性部分，確定了水凝膠的抗壓模量。值得注意的是，使用GelMA/AlgMA/HAP生物墨水的組具有比單獨使用GelMA的組更大的斷裂應變（圖1D）。復合水凝膠的抗壓強度和抗壓模量依次為50 kPa / 0.09 MPa，57 kPa / 0.12 MPa，和170 kPa / 0.40 MPa，分別對應GelMA，GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP（圖1E-F）。與GelMA水凝膠相比，引入AlgMA導致了抗壓強度和模量的增加，但差異在統(tǒng)計學上沒有顯著。此外，GelMA/AlgMA/HAP的抗壓模量顯著增加了約400%（圖1F）。

圖1 對合成的GelMA、GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP生物墨水以及它們相應的支架進行分析和評估

【3D生物打印支架可在體外維持長期細胞培養(yǎng)】

確保細胞的良好存活、附著和增殖對于工程組織支架非常重要，特別是對于封裝細胞的支架（圖2）。骨髓間充質干細胞（BMSCs）被封裝在生物墨水中，并打印成支架形狀（圖2A）�；�/死細胞檢測結果有力地證明，在整個14天的培養(yǎng)期間，所有組的細胞存活良好，驗證了生物墨水能夠維持BMSCs的長期存活能力（圖2C-D）。在初次打印時，細胞均勻分布在生物墨水中，呈現(xiàn)為離散的點狀。然而，隨著時間的推移，觀察到一個值得注意的現(xiàn)象。BMSCs向支架表面遷移，逐漸增殖并擴展其存在，最終形成復雜的三維細胞網(wǎng)絡。這些細胞網(wǎng)絡在培養(yǎng)7天后變得越來越明顯，伴有擴展的細胞細胞骨架。這些有力的觀察共同強調，在體外逐漸降解的同時，生物打印的支架保持結構穩(wěn)定，能夠支持BMSCs的培養(yǎng)。CCK-8試驗的結果也證實了這些發(fā)現(xiàn)（圖2B）�？傮w而言，本研究凸顯了三維生物打印的胞載體支架在長期培養(yǎng)過程中有效地促進細胞的存活和生長，為骨器官樣結構的形成奠定了基礎。

圖2 生物打印的負載骨髓間充質干細胞（BMSCs）的GelMA、GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP支架的生物相容性評估

【體外 3D 生物打印支架增強成骨分化】

在成功展示了生物打印支架的長期細胞培養(yǎng)潛力后，本研究進行了一個關鍵的驗證步驟，評估其作為干細胞載體形成復雜骨器官樣結構的能力。為進一步評估不同組的成骨潛能，本研究在體外培養(yǎng)40天后對支架進行了堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅（ARS）染色。ALP染色顯示GelMA/AlgMA/HAP組的ALP表達最高。ARS染色用于研究不同支架中BMSCs的礦化水平。ARS與鈣形成橙紅色螯合物，作為骨成骨礦化的指示物。GelMA和GelMA/AlgMA在茜素紅染色中顯示出最低的鈣或磷含量。相反，GelMA/AlgMA/HAP顯示出明顯的鈣和磷沉積，以及更多的鈣化結節(jié)（圖3A）。在體外培養(yǎng)14天后，我們通過測量ALP和ARS活性定量評估了BMSCs分化成成骨細胞的情況。GelMA/AlgMA/HAP組的ALP和ARS活性分別為2.01 ± 0.14和1.74 ± 0.11，比GelMA組分別高出近6倍和9倍（圖3B-C）。本研究對支架進行了溶解，并通過RT-PCR進一步評估所獲得的細胞。RT-PCR分析顯示，與其他兩組相比，GelMA/AlgMA/HAP組中成骨相關基因（包括Runx2、Col1A1、OCN和OPN）的表達水平明顯升高（圖3D）。GelMA/AlgMA組中Runx2、OCN和OPN的表達水平與GelMA組相比沒有顯著差異。然而，GelMA/AlgMA組中Col1A1的表達水平顯著升高，與GelMA組相比，這表明AlgMA增強了膠原蛋白的產(chǎn)生。為進一步驗證成骨相關蛋白的表達，進行了免疫印跡分析。免疫印跡結果表明，GelMA/AlgMA/HAP組中成骨相關蛋白（Runx2、BMP-2和OCN）的表達顯著高于GelMA和GelMA/AlgMA組（圖3E）。這進一步證明了GelMA/AlgMA/HAP不僅在基因水平上促進成骨，而且在蛋白水平上能夠增強成骨相關蛋白的表達。此外，圖像顯示，GelMA打印的支架邊界更清晰，而GelMA/AlgMA/HAP顯示出更模糊的邊界，表明細胞在GelMA/AlgMA/HAP生物墨水中生長和擴展。這些發(fā)現(xiàn)表明，形成骨器官樣結構的GelMA/AlgMA/HAP生物墨水可以誘導成骨分化和組織重塑。

圖3 生物打印的GelMA、GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP支架在體外增強了成骨能力

【骨類器官的體外自礦化】

在培養(yǎng)40天期間，使用微CT監(jiān)測（圖4）研究了生物打印的支架在體外礦物質形成和成熟過程中的情況。本研究將三組生物三維打印的支架在體外培養(yǎng)20天和40天，并使用微CT進行了體外礦化研究（圖4A）。微CT圖像顯示了GelMA、GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP在20天和40天的礦物質形成情況（圖4F-G）。在40天的培養(yǎng)期間，GelMA和GelMA/AlgMA幾乎沒有礦物質形成，而GelMA/AlgMA/HAP顯示出大量礦物質沉積。因此，體外培養(yǎng)40天的GelMA/AlgMA/HAP生物打印支架被確認為骨器官樣結構。在最初的20天內(nèi)，礦化主要發(fā)生在支架的外部。然而，20天后，礦化擴展到支架的內(nèi)部。從側面觀察，礦化組織在支架表面上呈現(xiàn)出比內(nèi)部更均勻的生長。相反，另外兩組在一段時間后沒有顯示出完整的支架結構。在20至40天期間，只有少數(shù)礦化斑點出現(xiàn)在GelMA和GelMA/AlgMA中，這表明在這些組中自我礦化過程主要發(fā)生在20天后。為評估HAPs的影響，還設置了一個對照組，其中包括未加載細胞的支架材料。然而，這些材料在沒有BMSCs的情況下無法礦化，并且在充分膨脹平衡后在微CT下沒有顯示出高密度信號。經(jīng)過20天浸泡，未加載BMSCs的GelMA/AlgMA/HAP沒有自我礦化。本研究還在時間上量化了總礦物體積（TMV）和器官樣礦物密度（OMD）（圖4B-C）。在第20天，GelMA/AlgMA/HAP組的TMV顯著高于其他組，而GelMA和GelMA/AlgMA組之間沒有顯著差異。

圖4 GelMA、GelMA/AlgMA生物打印支架以及GelMA/AlgMA/HAP生物打印骨器官樣結構在體外表現(xiàn)出自我礦化能力

【體內(nèi)骨類器官的形成和自我礦化】

為進一步研究它們在體內(nèi)重塑成大型和成熟的骨組織的能力，本研究通過在裸鼠皮下植入驗證了它們在體內(nèi)骨器官樣結構形成中的應用。為更準確地模擬體內(nèi)細胞生長微環(huán)境，在體外培養(yǎng)三天后將三維生物打印的水凝膠支架皮下植入裸鼠體內(nèi)。在不同的時間點評估支架的自我礦化和骨器官樣結構形成（圖5A）。使用HE染色的組織切片進行研究，發(fā)現(xiàn)生物打印的支架內(nèi)存在各種細胞類型（圖5B）。這表明BMSCs的有效分化。對于GelMA和GelMA/AlgMA，一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，特別是在支架的中心區(qū)域，某些區(qū)域保持相對完整，表明缺乏細胞。在這些組中，細胞主要分布在支架的邊緣。與之形成鮮明對比的是，在GelMA/AlgMA/HAP中，細胞表現(xiàn)出在整個支架上均勻擴散的顯著能力。本研究對關鍵骨相關因子和骨基質的關鍵成分（如OCN、OPN和Runx2）進行了特定的免疫染色。這些分析揭示了GelMA/AlgMA/HAP組中強大的骨形成能力，突顯了GelMA/AlgMA/HAP支持皮下骨發(fā)育的能力。相比之下，在GelMA和GelMA/AlgMA中，OPN和Runx2的表達主要在培養(yǎng)40天后增加（圖5C）。重要的是，在20天時間點上，這些組中OPN和Runx2的表達水平顯著低于GelMA/AlgMA/HAP骨器官樣結構。免疫組織化學的定量數(shù)據(jù)顯示，與GelMA和GelMA/AlgMA相比，GelMA/AlgMA/HAP中成骨蛋白（OCN、OPN和Runx2）的表達顯著增加（圖5D-F）。

圖5 GelMA、GelMA/AlgMA生物打印支架以及GelMA/AlgMA/HAP生物打印骨器官樣結構在體內(nèi)增強了成骨能力

定量數(shù)據(jù)證實了本研究的視覺觀察。為進一步證實BMSCs的分化，對膠原II、危險脂肪素和骨膜素等標記物進行了免疫熒光染色（圖6A-B）。GelMA/AlgMA/HAP中存在危險脂肪素+和骨膜素+細胞，證實了脂肪組織和成骨細胞的存在。相反，在另外兩組中，在20天和40天時這些差異幾乎不可觀察到。GelMA/AlgMA/HAP的免疫熒光染色結果顯示膠原II呈陽性，表明軟骨細胞的存在。與20天的體內(nèi)培養(yǎng)相比，40天的熒光強度明顯較弱，這表明GelMA/AlgMA/HAP中的骨化可能是通過內(nèi)生軟骨骨化進行的，定量熒光數(shù)據(jù)證實了這些觀察結果（圖6C-E）。

圖6 GelMA、GelMA/AlgMA生物打印支架以及GelMA/AlgMA/HAP生物打印骨器官樣結構在體內(nèi)形成，并展現(xiàn)多細胞分化的能力

根據(jù)免疫熒光染色的結果，本研究將在體內(nèi)培養(yǎng)20天的GelMA/AlgMA/HAP生物打印支架描述為“骨器官樣結構”。本研究3D打印了水凝膠支架并將其皮下植入裸鼠體內(nèi)，分別培養(yǎng)了20天和40天，然后進行了微CT研究體內(nèi)的自我礦化（圖7A）。羥基磷灰石生物打印支架在體內(nèi)培養(yǎng)40天后保持其結構，并發(fā)展成為白色骨狀結構（圖7D-E）。相比之下，GelMA和GelMA/AlgMA呈軟骨狀結構。此外，GelMA/AlgMA和GelMA/AlgMA/HAP的表面上有更多的血管比GelMA。利用微CT評估了生物打印支架的礦化和骨體積（圖7F）。微CT重建清楚地顯示出GelMA/AlgMA/HAP生物打印的骨器官樣結構發(fā)生了礦化，特別是在20天的體內(nèi)培養(yǎng)后，骨樣基質在邊緣區(qū)域積累更多。相比之下，另外兩組沒有顯示出礦化。在培養(yǎng)40天后，通過微CT觀察到了GelMA/AlgMA/HAP打印的骨器官樣結構的整個結構，包括多孔的結構（圖7G）。在體內(nèi)自我礦化研究中，本研究量化了TMV和OMD隨時間的變化。在20天和40天時，GelMA/AlgMA/HAP的TMV和OMD顯著高于其他組，而GelMA和GelMA/AlgMA之間沒有顯著差異（圖7B-C）。

圖7 GelMA、GelMA/AlgMA生物打印支架和GelMA/AlgMA/HAP生物打印骨器官樣結構在體內(nèi)表現(xiàn)出自我礦化能力

2. 總結與展望

總之，本研究成功地使用BMSCs在GelMA/AlgMA/HAP生物墨水中進行了大規(guī)模3D骨器官樣結構的生物打印。這些生物墨水為封裝的BMSCs提供了有利的環(huán)境，促進其活躍功能和自我礦化。在體內(nèi)環(huán)境中，這些生物打印的骨器官樣結構有效地引導骨生成、礦化、細胞層形成、塑性和重塑，最終促進了骨器官樣結構的發(fā)展。與實際骨組織，尤其是松質骨相比，本研究構建的骨器官樣結構具有類似松質骨的微觀和納米級多孔結構，明顯的羥基磷灰石晶相，實現(xiàn)了全面的結構模擬。在機械性能方面，與當前的水凝膠構建相比，本研究將構建的骨器官樣結構的機械強度提高了三個數(shù)量級，達到了GPa級，與SD大鼠的皮質骨沒有顯著差異。有趣的是，通過組織清除技術，本研究構建的骨器官樣結構形成了類似網(wǎng)絡狀的血管腔。這項研究突顯了使用GelMA/AlgMA/HAP骨器官樣結構通過3D生物打印創(chuàng)建功能化和簡化的骨修復生物框架的潛力。通過認識和解決骨器官樣結構構建的獨特需求和挑戰(zhàn)，研究人員可以在選擇合適的基質材料和生物墨水時做出明智的選擇，從而推動骨組織工程和再生醫(yī)學之間的界限。隨著我們繼續(xù)應對骨微環(huán)境的復雜性，未來可能會設計出大規(guī)模、功能增強的骨器官樣結構，能夠精確調控干細胞行為的多個方面，推動生物材料在骨組織再生方面的應用。

文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202309875