生物3D打印的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型模擬細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)性能異質(zhì)性

來(lái)源：賽箔生物

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最致命的原發(fā)性腦腫瘤，其特點(diǎn)是細(xì)胞和分子的高度異質(zhì)性，血管過(guò)密，以及先天的耐藥。細(xì)胞成分和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是GBM中異質(zhì)性的兩個(gè)主要來(lái)源。本文中，來(lái)自加州大學(xué)圣地亞哥分校的Tariq M. Rana和Shaochen Chen團(tuán)隊(duì)的Min Tang等作者開(kāi)發(fā)了具有腫瘤區(qū)域、無(wú)細(xì)胞ECM區(qū)域和內(nèi)皮區(qū)域的仿生物三區(qū)GBM模型，其區(qū)域硬度與GBM基質(zhì)、病理或正常腦實(shí)質(zhì)和腦毛細(xì)血管相對(duì)應(yīng)。DLP光固化生物3D打印技術(shù)的靈活性和多樣化的材料選擇允許對(duì)腫瘤模型的生物物理特性和生化特性進(jìn)行正交調(diào)制。

源于患者的GBM細(xì)胞、人類內(nèi)皮細(xì)胞和透明質(zhì)酸衍生物被用來(lái)建立一個(gè)人源化的微環(huán)境。這項(xiàng)體外研究表明，生物物理信號(hào)參與各種腫瘤細(xì)胞行為和血管生成潛力，并調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不同分子亞型。硬質(zhì)模型的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與間充質(zhì)亞型相似，腫瘤細(xì)胞呈彌漫性侵襲，并對(duì)替莫唑胺展現(xiàn)更高的藥物抗性，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出出芽式血管新生形態(tài)。軟質(zhì)模型表現(xiàn)出經(jīng)典亞型相關(guān)通路的富集，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出擴(kuò)張性細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究采用光固化生物3D打印技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、靈活和可重復(fù)的具有生物物理異質(zhì)性的患者特異性GBM模型，在未來(lái)的研究中可以作為一個(gè)可調(diào)控的系統(tǒng)來(lái)研究GBM疾病機(jī)制和篩選藥物。

3D生物打印的GBM模型具有區(qū)域不同的生物物理特性
為了再現(xiàn)空間上不均勻的ECM微環(huán)境，并探究ECM異質(zhì)性如何影響GBM的發(fā)展和內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，作者利用DLP 3D生物打印系統(tǒng)和腦瘤特異性ECM衍生的生物墨水，包括GMHA和GelMA，創(chuàng)建四個(gè)不同的模型：純腫瘤的硬質(zhì)模型、純腫瘤的軟質(zhì)模型、共培養(yǎng)的硬質(zhì)模型和共培養(yǎng)的軟質(zhì)模型（圖1A）。共培養(yǎng)模型中采用了人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）打印內(nèi)皮區(qū)域，以包圍腫瘤和ECM區(qū)域（圖1B）。對(duì)ECM區(qū)域，作者設(shè)計(jì)了兩種不同的硬度，以模仿GBM組織的硬度和健康大腦的硬度（圖1C）。作者進(jìn)一步使用這些具有不同機(jī)械性能的3D打印GBM模型，進(jìn)行在生物物理信號(hào)和培養(yǎng)條件下的評(píng)估，包括基因表達(dá)、藥物反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞遷移行為和血管生成活動(dòng)。（圖1E）。

圖1. 3D生物打印的GBM模型具有區(qū)域性的不同生物物理特性

與球狀體培養(yǎng)相比，3D模型具有不同的轉(zhuǎn)錄特征
主成分分析顯示，球狀體培養(yǎng)與任何一種3D培養(yǎng)相比都有截然不同的轉(zhuǎn)錄譜，而兩種3D培養(yǎng)之間的差異程度較�。▓D2A）。一些蛋白編碼的癌癥相關(guān)基因或預(yù)后基因在兩種3D培養(yǎng)條件下都上調(diào)了16倍以上（圖2B，C）。與球狀體相比，與 DNA復(fù)制、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分裂的通路在3D軟質(zhì)模型中明顯富集（圖2D）。

圖2. GBM球狀體培養(yǎng)和3D模型之間不同的轉(zhuǎn)錄譜表達(dá)

硬質(zhì)模型促進(jìn)了GBM的缺氧和致瘤性特征

與缺氧、癌癥侵襲性、E-cadherin缺失引起的轉(zhuǎn)移，以及對(duì)干擾素、炎癥、ECM和細(xì)胞凋亡等外部刺激的反應(yīng)的相關(guān)基因集在硬質(zhì)模型中明顯富集（圖3A，B）。低氧相關(guān)的基因，以及低氧相關(guān)的血管生成標(biāo)志物VEGFA和SPP1在硬質(zhì)模型中都被上調(diào)（圖3C）。免疫熒光（IF）染色顯示，軟質(zhì)模型中存在更多的KI67陽(yáng)性細(xì)胞（圖3D）。

3D模型誘導(dǎo)不同的GBM侵襲模式和轉(zhuǎn)錄亞型
TS576細(xì)胞和CW468細(xì)胞在軟質(zhì)模型中的侵襲面積分別是硬質(zhì)模型的7倍和4.4倍（圖3F）。與從軟質(zhì)模型中分離出的TS576細(xì)胞相比，從硬質(zhì)模型中分離出的TS576細(xì)胞高度富含原發(fā)性GBM組織特征（圖3G），表明硬質(zhì)模型將細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更具有臨床意義的狀態(tài)。

圖3. 生物物理模式化誘導(dǎo)了GBM細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)錄圖譜和侵襲模式

內(nèi)皮細(xì)胞在3D打印的模型中表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)模式和血管生成
在硬質(zhì)模型中，遷移的CD31+HUVECs表現(xiàn)出類似出芽的血管新生形態(tài)，并與SOX2+GBM細(xì)胞緊密接觸（圖4A）。血管生成標(biāo)志物SPP1和VEGFA在所有的3D模型中都是上調(diào)的，并且在硬質(zhì)模型或共培養(yǎng)模型中明顯富集（圖4B）。

GBM-內(nèi)皮細(xì)胞交流增強(qiáng)了腫瘤的侵襲和抗藥性
腫瘤細(xì)胞在軟質(zhì)共培養(yǎng)模型中以類纖維細(xì)胞形態(tài)擴(kuò)增，而在硬質(zhì)模型中則以更圓的形態(tài)擴(kuò)增（圖4C）。與球狀體培養(yǎng)的細(xì)胞相比，所有3D生物打印模型中腫瘤細(xì)胞都顯示出對(duì)TMZ的耐藥性增強(qiáng)（圖4D）。qPCR分析顯示，耐藥性相關(guān)基因如ABCG2和CXCL12在硬質(zhì)共培養(yǎng)條件下分別上調(diào)了8倍和24倍（圖4E），與TMZ治療反應(yīng)一致。

圖4. 硬質(zhì)模型誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的萌芽血管生成，增強(qiáng)了GBM細(xì)胞的抗藥性

結(jié)論
本研究中，腫瘤區(qū)和內(nèi)皮區(qū)被設(shè)計(jì)成具有類似于其原始狀態(tài)的硬度。在腫瘤區(qū)和內(nèi)皮區(qū)之間打印了專門(mén)設(shè)計(jì)的ECM區(qū)域的兩種硬度條件，以模仿GBM重塑的基質(zhì)或健康的腦實(shí)質(zhì)硬度，并誘導(dǎo)不同的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和行為。細(xì)胞在軟質(zhì)模型中迅速增殖和擴(kuò)增；在硬質(zhì)模型中，與惡性表型有關(guān)的缺氧、干性和血管生成能力得到加強(qiáng)。

腫瘤細(xì)胞在兩種硬度的微環(huán)境中以不同的形態(tài)和模式侵入ECM區(qū)域。硬質(zhì)模型中表現(xiàn)出單細(xì)胞彌漫性侵襲模式，而軟質(zhì)模型中則表現(xiàn)出擴(kuò)張性生長(zhǎng)模式。這兩種侵襲模式都在GBM細(xì)胞中被觀察到過(guò)，這表明硬度變化模型可能適合模擬GBM發(fā)展的不同狀態(tài)。基因集富集分析表明，這兩種硬度適合模擬不同的GBM亞型。

血管化是GBM的一個(gè)特征，它促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，有利于腫瘤的侵襲�；�因表達(dá)顯示，硬質(zhì)模型中的腫瘤細(xì)胞表達(dá)了較高的血管生成標(biāo)志物，與硬質(zhì)模型中觀察到的出芽表型一致。軟質(zhì)模型促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的侵襲面積增大和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

對(duì)所有模型和球體培養(yǎng)對(duì)照的TMZ用藥處理處理結(jié)果顯示，硬質(zhì)共培養(yǎng)模型的腫瘤細(xì)胞存活率最高，這表明硬質(zhì)條件以及與內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)增強(qiáng)了GBM的抗藥性。

本研究中提出的三區(qū)硬度模式的GBM模型是第一個(gè)將GBM的生理相關(guān)的生物物理異質(zhì)性與生化相關(guān)的ECM材料相結(jié)合的模型。區(qū)域硬度更好地再現(xiàn)了原生環(huán)境，并可能有利于更多的生物模擬細(xì)胞-ECM和細(xì)胞相互作用。未來(lái)可用這些模型來(lái)研究GBM的不同亞型以及GBM的不同階段。硬度變化也可應(yīng)用于未來(lái)的模型，研究生物物理對(duì)其他腫瘤-基質(zhì)相互作用的影響。

原文：https://doi.org/10.1002/smll.202006050