納米粒子也能治療癌癥？姜黃素結(jié)合3D腫瘤模型給出肯定答案

來(lái)源： EngineeringForLife

與傳統(tǒng)治療方法相比，納米藥物因其具有更好的靶向性、更高的給藥效率和良好的水溶性而引起越來(lái)越多的關(guān)注。然而，傳統(tǒng)的藥物療效評(píng)估方法是基于單細(xì)胞的2D培養(yǎng)方法來(lái)獲得體外治療效果，這可能不能代表實(shí)際腫瘤。基于上述考慮，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型成為更好的選擇，因?yàn)樗鼈兛梢栽黾芋w外系統(tǒng)的復(fù)雜性，并提供比2D培養(yǎng)更接近體內(nèi)原生的仿生微環(huán)境。

為此，來(lái)自大連理工大學(xué)的宋克東研究員將聚合非離子表面活性劑(Pluronic F127)與姜黃素結(jié)合，制備了水溶性好、治療腫瘤效果好的姜黃素納米顆粒(CurNPs)（圖1）。以納米粘土、海藻酸鈉和明膠為基礎(chǔ)制備的雜化支架具有良好的印刷相容性和良好的生物相容性。之后使用支架結(jié)合的轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MDA-MB-231)細(xì)胞構(gòu)建3D腫瘤模型，研究了CurNPs對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療作用（圖1）。相關(guān)研究成果以“Curcumin nanoparticles combined with 3D printed bionic tumor models for breast cancer treatment”為題于2022年12月8日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 CurNPs聯(lián)合3D打印Gel/Alg/NC支架治療乳腺癌腫瘤示意圖

1. CurNPs的制備及其性能特征
首先，作者以姜黃素(Cur)和Pluronic F-127 (PF127)為原料采用納米沉淀法制備了姜黃素納米顆粒(CurNPs)。通過(guò)各種理化表征對(duì)CurNPs的性質(zhì)進(jìn)行了特異性分析，并通過(guò)體外藥物篩選，研究了CurNPs在二維環(huán)境下對(duì)乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)和正常細(xì)胞(L929)的細(xì)胞毒性。（圖2）。

圖2 CurNPs的生物毒性試驗(yàn)

2. 生物墨水的特征
在二維環(huán)境下的單細(xì)胞研究無(wú)法模擬體內(nèi)微環(huán)境的固有細(xì)胞組成和行為特征，從而限制了其體外和體內(nèi)效應(yīng)之間的精確對(duì)應(yīng)因此，為了更好地模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，作者對(duì)具有良好生物相容性和流變性能的3D打印Gel/Alg/NC支架進(jìn)行了研究。

將海藻酸鹽/明膠前驅(qū)體溶液中加入納米粘土（NC）作為打印支撐材料，在超純水中按5:4:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比(Gel:NC:Alg)制備得到的油墨粘性更大（圖4a左）。流變結(jié)果表明所制備的油墨具有良好的剪切減薄性能和良好的印刷適性。油墨之間存在較強(qiáng)的相互作用力，這為印刷后的形狀保持奠定了良好的理論基礎(chǔ)。此外，油墨的觸變性表征了流體粘度對(duì)時(shí)間的依賴(lài)關(guān)系。還測(cè)量了剪切應(yīng)力隨剪切速率的變化，結(jié)果表明，剪切應(yīng)力-剪切速率曲線的面積較大，說(shuō)明油墨的觸變性大，穩(wěn)定性高，不易變形（圖3）。

圖3 Gel/Alg/NC油墨的流變性能測(cè)試

由此打印出的支架結(jié)構(gòu)平整，具有良好的支撐性能，不易倒塌（圖4a右）。利用掃描電鏡可以更直觀地觀察到鈣離子交聯(lián)和EDC/NHS/MES二次交聯(lián)后3D打印支架的微觀形貌。從圖6b可以發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)后的支架孔隙明顯，表面不規(guī)則且粗糙(圖4c)，這為細(xì)胞的粘附奠定了基礎(chǔ)。EDS進(jìn)一步說(shuō)明了支架的組成成分，接觸角的降低說(shuō)明支架的親水性良好更有利于細(xì)胞的粘附。

圖4 三維Gel/Alg/NC支架的物理性能表征

3. CurNPs在三維腫瘤模型/環(huán)境中的細(xì)胞毒性試驗(yàn)及其作用機(jī)制
良好的生物相容性是建立腫瘤模型的先決條件。本研究首先采用活/死染色和CCK-8法檢測(cè)支架上L929細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖情況，為腫瘤模型的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明3D打印Gel/Alg/NC雜化支架中L929細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活性均較好，兩組間增殖能力無(wú)明顯差異。說(shuō)明所制備的Gel/Alg/NC雜化支架具有良好的生物相容性，均能促進(jìn)成年正常細(xì)胞(L929)和乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)的粘附和增殖(（圖5）。

圖5 三維Gel/Alg/NC復(fù)合支架細(xì)胞增殖試驗(yàn)

此外，作者還對(duì)CurNPs在三維腫瘤模型/環(huán)境中的細(xì)胞毒性進(jìn)行了試驗(yàn)。對(duì)于用CurNPs處理的腫瘤模型，如圖6所示，隨著時(shí)間的增加，加入CurNPs后，綠色熒光逐漸減少，表明活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而紅色熒光逐漸增加，表明死亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。在CurNPs處理的2D孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)達(dá)到了約90%的細(xì)胞死亡率。

圖6 CurNPs在3D Gel/Alg/NC雜化支架上的細(xì)胞毒性測(cè)試

接下來(lái)，作者通過(guò)3D Gel/Alg/NC支架的H&E染色進(jìn)一步研究了CurNPs對(duì)3D培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷作用(圖7)。從H&E染色結(jié)果可以看出，CurNPs處理4天后，空白對(duì)照組的大部分細(xì)胞呈球形聚集狀態(tài)。而CurNPs組的細(xì)胞數(shù)量較未處理的空白對(duì)照組更為稀疏和分散，且大部分細(xì)胞核可見(jiàn)斷裂，導(dǎo)致染色效果較差。上述結(jié)果表明，CurNPs能夠抑制3D Gel/Alg/NC支架培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞，具有良好的細(xì)胞毒性（圖7）。

圖7 H&E染色分析CurNPs對(duì)3D腫瘤模型MDA-MB-231的影響

接下來(lái)，作者進(jìn)一步在3D支架上通過(guò)免疫熒光檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中凋亡蛋白(Bcl-2和Bax)的表達(dá)，探討CurNPs對(duì)腫瘤模型的作用機(jī)制。與對(duì)照組相比，三維支架腫瘤模型中MDA-MB-231細(xì)胞的Bcl-2熒光(488 nm和594 nm)表達(dá)在CurNPs處理4 d后顯著降低(P < 0.001)。定量分析顯示Bcl-2熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，表明CurNPs可以抑制Bcl-2的表達(dá)（圖8a-b）。然后分析細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子Bax的表達(dá)，CurNPs處理的三維腫瘤模型顯示出明顯的熒光增強(qiáng)，表明CurNPs可以上調(diào)支架內(nèi)MDA-MB231細(xì)胞中Bax的表達(dá)（圖8c-d）。上述結(jié)果表明，CurNPs可以通過(guò)改變3D腫瘤模型MDA-MB-231細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖8 CurNPs處理的3D Gel/Alg/NC支架的免疫熒光分析

4. CurNPs和3D打印Gel/Alg/NC支架的生物安全性評(píng)價(jià)
最后，作者通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)評(píng)估了CurNPs和3D Gel/Alg/NC支架的體內(nèi)血液相容性。結(jié)果表明在CurNPs和3D支架中均沒(méi)有溶血現(xiàn)象（圖9a-b）。作者又分別在96孔板中取出100μl溶血樣品，在570 nm波長(zhǎng)下，每個(gè)樣品平行檢測(cè)3個(gè)，計(jì)算溶血率，結(jié)果如圖9c-d所示，實(shí)驗(yàn)組溶血率接近0%，與圖9a-b結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了CurNPs和3D Gel/Alg/NC支架均具有良好的血液相容性和生物安全性。

圖9 CurNPs與3D Gel/Alg/NC支架的血液相容性研究

綜上，本文通過(guò)簡(jiǎn)單的納米沉淀法成功制備了一種納米治療藥物CurNPs，所制備的CurNPs具有良好的生物相容性、滿足的水溶性、良好的發(fā)光性、通過(guò)EPR效應(yīng)有效的細(xì)胞內(nèi)食以及有效的腫瘤治療效果等優(yōu)點(diǎn)。此外，通過(guò)簡(jiǎn)單的合成方法建立了具有良好力學(xué)和流變學(xué)性能的體外支架腫瘤模型，并通過(guò)CCK8、活/死細(xì)胞染色、SEM等方法驗(yàn)證了該三維支架能夠更好地模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，能夠較好地代表實(shí)際腫瘤，從而更準(zhǔn)確地進(jìn)行體外藥物篩選�；�于上述分析，本研究為構(gòu)建多功能納米藥物體外藥物篩選多平臺(tái)開(kāi)辟了新途徑。

文章來(lái)源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/aca5b8